铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族鉴定及生物信息学分析

[目的]鉴定铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族成员,并进行生物信息学分析,为深入研究该家族在铁皮石斛热应激响应中的调控机制提供理论参考.[方法]以拟南芥和水稻Hsf蛋白氨基酸序列为参考序列,在铁皮石斛蛋白数据中搜索其同源蛋白序列,利用SMART和Pfam数据库鉴定出其Hsf基因家族成员.利用生物信息学方法对铁皮石斛Hsf基因家族组成、基因结构、启动子区顺式作用元件及其编码蛋白结构域和进化关系等进行分析.[结果]共鉴定获得23个铁皮石斛Hsf基因家族成员,编码氨基酸数量为132~514个,平均343个,多数属于酸性蛋白和亲水性蛋白,可分为HsfA、HsfB和HsfC组,其中HsfA组成员13个、HsfB组成员9个、HsfC组成员1个.除DoHsfA3仅包含motif 1和motif 2外,其他HsfA组蛋白均含有motif 1~motif 5,HsfB和HsfC组蛋白均缺少motif 5.铁皮石斛Hsf蛋白缺少A9、B3、B5和C1亚类成员,与同属于单子叶兰科植物的小兰屿蝴蝶兰Hsf蛋白亲缘关系最近.HsfA组成员包含完整的HSF功能域和卷曲螺旋(CC)功能域,HsfB和HsfC组成员缺少或含不完整的CC功能域.DoHsfA1A蛋白具有保守的丝氨酸—苯丙氨酸—缬氨酸—精氨酸—谷氨酰胺序列.铁皮石斛Hsf基因启动子区含有大量激素响应、胁迫响应和生长相关元件.[结论]铁皮石斛Hsf基因家族成员进化较保守,其生物学功能存在明显物种特异性,进化关系较复杂,推测其在不同的非生物胁迫和植物激素信号途径中发挥潜在"节点"作用.     

墨兰 CsAP1-A 基因克隆及表达分析

【目的】AP1 基因在植物的花器官发育和开花调控中发挥重要作用，对墨兰 AP1 基因进行克隆与表达分析可为研究其在墨兰花发育和开花调控中的作用提供前期基础。【方法】以墨兰品种‘小香’为材料，克隆到 1 个 AP1 基因，命名为 CsAP1-A。通过生物信息学分析其基因结构、蛋白结构域和进化关系，利用 RT-qPCR 方法分别检测 CsAP1-A 在墨兰不同器官、不同花发育阶段和不同花组织部位的表达情况；通过转录组测序分析 CsAP1-A 在 5 个不同花型墨兰品种花组织部位的表达情况；通过蛋白互作预测软件分析 CsAP1-A 与其他蛋白的互作关系。【结果】CsAP1-A 基因编码区为 744 bp，编码 248 个氨基酸，含有高度保守的 MADS-box 和K-box 结构域，符合 MADS-box 转录因子家族特征。CsAP1-A 与其他兰科植物 AP1 蛋白相似性较高，其中与春兰 AP1/FUL3（APY18447.1）和蕙兰 MADS1（AGE15496.1）的同源性最高。RT-qPCR 分析结果表明，CsAP1-A在墨兰不同器官中均有表达，在花中表达量最高，且集中在花芽分化初期（S1）高表达。在不同花型的墨兰品种中，CsAP1-A 在 WT（普通型）、MPV（重瓣花型）、LaPV（花瓣唇瓣化花型）和 NLV（唇瓣萼片化花型）4 种花型的合蕊柱中表达量均最高，而在萼片中表达量最低；在合蕊柱异常发育的 MPV 中，CsAP1-A 在合蕊柱的表达量显著提高，而在花瓣蕊柱化的梅瓣花型（GPV）中整体表达量最高，且表达区域从合蕊柱扩展到花瓣。蛋白互作预测 CsAP1-A 蛋白可与 MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等 10 个蛋白存在互作关系。【结论】墨兰 CsAP1-A 的基因结构、进化关系、时空表达情况和蛋白互作预测可为墨兰花发育的研究提供理论依据，对进一步揭示 CsAP1-A 基因在墨兰成花过程中的作用奠定基础。     

茄病镰孢菌对铁皮石斛的致病性研究

研究茄病镰孢菌(Fusarium solani)对铁皮石斛(Dendrobium officinale)的致病性。试验组通过穿刺接种将茄病镰孢菌菌悬液接种于铁皮石斛组培苗及成苗的根部和叶片,植物发病后从病变植株中分离致病菌,并结合形态和分子生物学方法进行鉴定。正常对照组接种无菌水。对照组的铁皮石斛正常生长,试验组的铁皮石斛发生不同程度的病变,病原菌经形态和分子生物学鉴定显示为茄病镰孢菌。茄病镰孢菌对铁皮石斛有致病性。     

铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

SEP3(SEPALLATA3)基因是MADS-box家族中的一员,在花器官的形成和发育过程中具有重要作用.为了解SEP3基因在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的成花转变机理,从铁皮石斛转录组序列中获得一个SEP3基因序列,并命名为DoSEP3.预测其编码区长度为354 bp,预测编码117个氨基酸.DoSEP3蛋白相对分子质量13457.87 Da.其不稳定系数为60.53,亲水性的平均值为-0.121,是不稳定的亲水性蛋白,主要在内质网和细胞核中起作用.二级结构主要以α-螺旋为蛋白质最大量的结构元件,跨膜区分析推测DoSEP3蛋白质具有一个跨膜区.进一步的氨基酸比对显示,铁皮石斛DoSEP3蛋白与金钗石斛SEP3蛋白亲缘关系最近,可能具有类似的功能.基于生物信息学分析,利用CRISPR/cas9技术构建铁皮石斛基因敲除载体,并使用农杆菌介导法进行遗传转化,且已获得阳性原球茎,可为后续的SEP3基因表达研究奠定基础.     

石斛抗氧化和滋阴作用的试验研究

[目的]研究金钗石斛、鼓槌石斛和铁皮石斛的抗氧化和滋阴药效异同,为其临床用药提供一定的科学依据。[方法]采用DPPH.清除率检测法评价其体外抗氧化活性;并采用氢化可的松建立阴虚大鼠模型,用试剂盒法测定血清中的超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和乳酸脱氢酶(LDH)的活力,并计算大鼠体重、进食量以及死亡率,评价石斛滋阴效果。[结果]体外抗氧化试验表明,3种石斛的抗氧化作用强弱为:铁皮石斛鼓槌石斛金钗石斛,铁皮石斛与鼓槌石斛抗氧化活性和Vc接近,金钗石斛次之;浙江产铁皮石斛和云南产鼓槌石斛抗氧化效果相当,均优于其他产地的。滋阴试验结果表明,铁皮石斛和鼓槌石斛滋阴作用等同,金钗石斛次之。[结论]铁皮石斛、金钗石斛和鼓槌石斛抗氧化和滋阴有差异,在临床使用时可有选择的使用。     

鄂马铃薯3号遗传转化体系的构建与表达

以鄂马铃薯（Solanum tuberosum L.）3号为试验材料，将含有来源于黄芪的硒代半胱氨酸甲基转移酶基因（AbSMT）的质粒pBinAr进行PCR扩增以及酶切连接构建重组转化子pBI121-AbSMT，运用农杆菌转化法，设置农杆菌菌液浓度梯度、侵染时间以及共培养时间组合进行遗传转化，并且通过PCR鉴定以及GUS组织化学染色进行基因表达验证。结果表明，筛选抗生素是50.00 mg/L的Kan，农杆菌菌液浓度为0.50(OD600 nm)，侵染时间为8 min，共培养时间为3 d，能够实现鄂马铃薯3号高效遗传转化，同时成功构建了AbSMT基因转化的鄂马铃薯3号。     

铁皮石斛不同阶段多糖和甘露糖含量研究

以软脚红杆铁皮石斛为实验材料,参考《中国药典》（I部）标准,对其原球茎、丛生芽、瓶苗茎、炼苗茎和鲜条进行多糖和甘露糖含量的检测。结果表明：（1）软脚红杆铁皮石斛不同阶段多糖和甘露糖含量都达到了中国药典的标准。（2）软脚红杆铁皮石斛植株在不同生长阶段,多糖和甘露糖含量差异较小。（3）人工组培的石斛不同阶段中,都含有丰富的多糖和甘露糖,具有较高的营养价值;原球茎与鲜条的多糖和甘露糖含量差异虽然不大,但与鲜条相比,具有生长时间短、简单易得等优势。（4）在当今野生铁皮石斛紧缺的情况下,通过组培方式获得的铁皮石斛原球茎和丛生芽,可以弥补野生铁皮石斛资源不足的问题。     

农杆菌介导的PEPCase基因导入小麦的初步研究

利用根癌农杆菌遗传转化系统,以普通小麦扬麦158为材料,将玉米泛生素基因启动子(Ubi)驱动下的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因,以及潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)导入预培养10~12 d小麦胚性愈伤组织中。经过在含100~150 mg.L-1潮霉素(hyg)的筛选培养基上连续筛选,获得了hyg抗性植株。经GUS组织化学染色检测和PCR鉴定,其中的9棵含有Ecppc基因,PCR阳性植株比例为3.03%。初步鉴定已成功地建立了小麦遗传转化系统,为进一步探讨PEPCase基因在植物中的转化和表达奠定了基础。     

铁皮石斛查尔酮合酶基因克隆与表达分析

[目的]克隆铁皮石斛中查尔酮合酶(CHS)基因,分析其基本生物学信息及组织表达特异性,为进一步研究CHS基因在铁皮石斛中的表达调控机理及其在铁皮石斛中的功能打下理论基础.[方法]采用铁皮石斛转录组序列与NCBI同源序列进行比对,根据保守区段设计引物克隆铁皮石斛CHS基因的cDNA全长,采用实时荧光定量PCR定量表达分析不同生长年限、不同组织部位中CHS基因的表达水平.[结果]铁皮石斛CHS基因cDNA编码区1188 bp,编码395个氨基酸,GenBank登录号KT783451,分子量为43.2 kD,理论等电点6.05.铁皮石斛GHS氨基酸序列与同属植物金钗石斛(Dendrobium nobile)的CHS氨基酸序列同源性最高,达99%,与非同科植物欧洲大叶杨(Populus trichocarpa)、巨桉(Eucalyptus grandis和紫玉兰(Magnolia liliiflora)等植物的同源性在83%左右.该基因编码的蛋白质属非分泌蛋白,定位于细胞质基质中,为非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白.CHS基因在1年生铁皮石斛叶片中的表达量最高,随着植株年龄的增长,叶片中CH基因的表达量降低,茎中的表达量升高.[结论]铁皮石斛CHS基因早期主要参与激素运输和器官形态建成,后期主要参与类黄酮物质合成.     

东莞大蕉超表达拟南芥CBF1基因及其抗寒性检测

【目的】研究超表达拟南芥CBF1基因（AtCBF1）对大蕉抗寒性的影响,为从大蕉克隆抗寒相关基因奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法转化东莞大蕉的胚性细胞悬浮系,获得转AtCBF1基因的大蕉植株;利用GUS组织染色、PCR、RT-PCR以及RT-qPCR对转基因植株进行鉴定;比较低温处理后的转基因株系和对照的冷害特征以及超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量等生理生化指标,鉴定转基因大蕉植株的抗寒能力。【结果】试验共获得6个抗性再生转化系。GUS组织染色结果表明,除T1外,其余均为阳性;PCR鉴定结果表明,AtCBF1在6个抗性再生转化系均为阳性,而GUS基因在T1转化系中没有检测出;RT-PCR结果表明,AtCBF1在6个转化系均得到表达,对T1、T2和T3 3个转化系进行RT-qPCR检测发现,AtCBF1基因在3个转基因株系表达水平存在差异;在低温处理下,转基因植株的叶片相对电导率、MDA的累积都低于非转基因植株,而SOD总活性高于对照;低温处理条件下,转基因植株叶片的冷害症状明显轻于对照。【结论】AtCBF1在大蕉中超表达,具有增强大蕉SOD活性,降低因低温导致的MDA含量和离子渗漏率,缓解质膜过氧程度,进而改善大蕉植株抗低温胁迫的能力。     

铁皮石斛组织培养研究进展

铁皮石斛(Dendrobium officinale)是中国的珍贵中药材,目前,铁皮石斛野生资源稀缺,组织培养是铁皮石斛快速繁殖的有效途径。近年来,铁皮石斛组织培养上的研究主要有种子无菌萌发,外植体诱导原球茎发生、增殖与分化,在培养基上生根与壮苗等,大量研究表明,以铁皮石斛茎段为外植体进行组培更易获得试管生根苗。原球茎增殖与分化最适基础培养基是MS,NAA浓度为0.5 mg/L时,铁皮石斛生根率为100%,且长势良好,生长健壮。配以一定的添加物能使之更快形成幼苗。同时,幼苗壮苗以MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基为最佳,茎粗、苗高、叶长,效果最好。但是铁皮石斛组织培养周期长是其快速繁殖中存在的主要问题,对此,建议可以通过遗传变异、单倍体诱导、离体开花授粉等非常规育种方式,快速培育优良品种,或者在进行组织培养研究时,直接以组织培养物替代原药材使用或者生产活性成分等方面进行研究。     

深色有隔内生真菌(DSE)引进菌株对铁皮石斛的接种效应

[目的]深色有隔内生真菌(DSE)是一类与植物共生的内生真菌,研究DSE对铁皮石斛苗生长的影响,可为铁皮石斛专用菌肥的开发利用提供理论依据.[方法]试验分为7个DSE菌株分别与铁皮石斛组培苗和盆栽苗共生培养两个阶段,按不同DSE菌株接种铁皮石斛组培苗设7个处理,另以不接种菌株为对照处理,测定不同处理下铁皮石斛组培苗生长指标;按不同DSE菌株制成的菌液浇灌盆栽苗设7个处理,以未浇菌液为对照处理,测定不同处理下铁皮石斛盆栽苗生长指标.[结果]供试菌株均能与铁皮石斛苗共生,其中菌株24L-4处理的促生作用较为突出;接种该菌株后,铁皮石斛组培苗的株高、叶宽、茎径和干重分别较对照处理显著增长33.3%、65.7%、27.3%和45.1%;铁皮石斛盆栽苗的茎径、鲜重和干重分别较对照显著增长104.0%、83.9%和114.7%;显微镜观察发现该菌株的深色有隔菌丝和类似微菌核的定殖结构分布于铁皮石斛根部皮层的细胞内.[结论]DSE真菌能明显提高铁皮石斛的生产能力,具有较好的开发利用潜力.     

铁皮石斛内生真菌的研究进展

铁皮石斛是国家珍稀药用植物。自然状态下,只有真菌与种子或根形成共生关系后,才能正常地萌发和生长发育。研究铁皮石斛内生真菌对挽救这一濒危物种具有重要的意义。该文对铁皮石斛内生真菌的多样性和促生作用的研究进展进行综述,为进一步研究提供参考。     

Sporamin引导肽基因序列与sacB基因融合植物表达载体的构建

枯草杆菌（Bacillus subtilis）果聚糖蔗糖转移酶基因（SacB）在植物中表达，可以明显提高果聚糖的积累，增强植物的耐寒、耐旱和抗盐碱的能力。本实验采用PCR方法从枯草杆菌基因组中扩增出果聚糖蔗糖转移酶基因（SacB），序列分析结果与Ebskamp公布的编码果聚糖转移酶基因氨基酸序列同源性为100％采用PCR方法从甘薯总DNA中获得sporamin基因的定位于液泡的引导肽序列，序列分析与GenBank上公布的sporamin基因引导肽氨基酸序列同源性为97％。将sporamin引导肽基因序列与sacB基因体外重组，构建了融合植物表达载体pBI-sacB和pBI-sp-sacB，为下一步作物的遗传转化打下了基础。     

Liquid Suspension Culture of the Seeds of CAULIS DENDROBH

[目的]研究铁皮石斛种子的液体悬浮培养方法.[方法]以MS为基础培养基,设计了不同浓度的基础培养基、激素、天然附加物、pH、蔗糖等5个影响因子的15种培养液配方,筛选出铁皮石斛最适的液体培养条件.[结果]适中的无机盐浓度,NAA、较低的pH值、较高的蔗糖浓度以及适量的土豆汁都有利于铁皮石斛种子的萌发;试验优选出的相对适合种子萌发的培养基为1/2MS+0.5 mg/LNAA +80 g/L土豆汁+45 g/L蔗糖.[结论]筛选出了相对较合适的培养基配方,为铁皮石斛栽培种植提供了理论依据.     

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转化大豆的研究

本研究利用农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入大豆,以提高大豆的耐盐性。对132棵转化植株进行了PCR检测,获得64棵阳性植株,阳性率达到48%。对PCR阳性植株进一步进行Southern杂交分析,证明BADH基因已经整合到大豆基因组中。     

铁皮石斛糖苷水解酶GH3基因家族鉴定及表达模式分析

利用生物信息学方法对铁皮石斛GH3基因家族成员进行筛选、鉴定,对其基因结构、蛋白理化性质、亚细胞定位、系统进化、蛋白质二级结构及跨膜预测、基序及染色体定位进行分析,同时分析GH3基因家族在不同组织以及低磷与正常磷水平下的表达模式。在铁皮石斛全基因组中筛选得到13个GH3家族基因,其中一个基因存在可变剪切,表达为14个GH3蛋白。GH3基因家族蛋白可分为3个亚家族,各亚家族中不同基因相对保守;各成员均含有内含子与外显子,内含子相位在0～2,13个基因分布在8染色体上。GH3基因家族在铁皮石斛的8个组织中均有表达,其中白根和花蕾表达量高,茎和唇瓣低,推测GH3基因家族可能参与铁皮石斛根系生长以及开花现蕾。低磷与正常磷水平表达结果表明,低磷水平下叶中基因LOC110110392、LOC110100144表达上调,根中基因LOC110095762、LOC110107269表达上调。该研究对铁皮石斛糖苷水解酶GH3基因家族成员生物信息学、在不同组织以及正常磷与低磷条件下的表达水平进行研究分析,筛选响应低磷信号的糖苷水解酶基因,为后期研究糖苷水解酶参与低磷条件下铁皮石斛多糖代谢调节机制提供研究基础...     

铁皮石斛种子液体悬浮培养的研究

[目的]研究铁皮石斛种子的液体悬浮培养方法。[方法]以MS为基础培养基,设计了不同浓度的基础培养基、激素、天然附加物、pH、蔗糖等5个影响因子的15种培养液配方,筛选出铁皮石斛最适的液体培养条件。[结果]适中的无机盐浓度,NAA、较低的pH值、较高的蔗糖浓度以及适量的土豆汁都有利于铁皮石斛种子的萌发;试验优选出的相对适合种子萌发的培养基为1/2MS+0.5 mg/LNAA+80 g/L土豆汁+45 g/L蔗糖。[结论]筛选出了相对较合适的培养基配方,为铁皮石斛栽培种植提供了理论依据。     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

微波萃取-CE-ICP—OES分析铁皮石斛中钙镁形态

利用微波萃取-毛细管电泳（cE）-电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP—OES）联用技术，在电泳缓冲溶液为50mm01／LNaAc—HAc（pH5．5）、电泳电压为20kv的条件下，分析中草药铁皮石斛中钙镁元素的形态。结果表明，铁皮石斛中钙以6种形态存在，镁以3种形态存在；以标准游离钙镁表征得到铁皮石斛中游离态钙镁的含量分别为5．95、5．27mg／L；在最佳试验条件下，钙、镁检出限分别为0．031、0．025mg／L，加标回收率为96．1％～98．3％。说明该方法用于分析铁皮石斛中钙镁形态是可行的，其为中药中金属元素形态研究提供了一条可靠途径，对中药开发利用及相关药物研究具有重要参考价值。