蜡状芽胞杆菌中超氧化物歧化酶的提取

采用超声波法、甲苯法，乙醇－氯仿法及蜗牛酶裂解法进行了蜡状芽胞杆菌的超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）提取试验，并用邻苯三酚自氧化法测定ＳＯＤ的活性。结果显示，蜡状芽胞杆菌中含有ＳＤＯ。超声波法和甲苯法可以从该菌中提出ＳＯＤ，而乙醇－氯仿法及喁酶裂解法则未能提出ＳＯＤ。     

尖峰岭热带雨林土壤中可培养芽胞杆菌多样性分析

采用热处理法从海南省尖峰岭热带雨林土壤中分离出164株芽胞杆菌,运用16S rDNA PCR-RFLP与序列分析技术对所得菌株进行遗传多样性分析。根据16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱的UPGMA聚类分析,在相似性为100%的水平上,分离到的164株芽胞杆菌分属于23个酶切类型,显示出丰富的遗传多样性。16S rDNA序列分析结果表明,这些菌株主要分布于Bacillus(52%)、Paenibacillus(36%)、Lysinibacillus(4%)、Brevibacillus(4%)和Psychrobacillus(4%)5个属,其中优势属为Bacillus;有6株芽胞杆菌的16S rDNA序列与数据库中相应模式菌株的最大相似性为98.3%~99.0%,可能为潜在的芽胞杆菌新种资源。     

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示外源蛋白的研究进展

枯草芽胞杆菌是一种生物安全的革兰氏阳性细菌,在营养匮乏的环境下,可形成具有强抗逆性的芽胞。枯草芽胞杆菌的芽胞由核心、皮层、孢子外套蛋白三部分组成,目前已成功利用枯草芽胞杆菌芽胞外套蛋白CotB、CotC、CotG、CotX和OxdD为载体,将酶蛋白、抗原蛋白或荧光标记蛋白等展示于芽胞表面。芽胞表面展示的蛋白通常具有较好的稳定性、易于纯化和安全性好等优点,可应用于医药、食品及饲料工业等领域,具有较大的应用前景。详细介绍了枯草芽胞杆菌芽胞的分子特点及芽胞表面展示系统的构建过程及其应用前景,为芽胞表面展示载体的基础及应用研究奠定基础。     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因克隆与序列分析

根据蜡质芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因序列,设计特异PCR引物,对本实验室保存的 16个苏云金芽孢杆菌 (Bt)菌株进行检测.结果显示, 15个菌株含有肠毒素基因片段.克隆了Bt8010肠毒素entS基因的编码框 (ORF)序列, 将该序列测序,用在线的BLAST软件与DNASIS软件进行同源性分析.结果表明,该基因与已知的Bc和炭疽芽孢杆菌肠毒素基因有很高的同源性,但该基因有 12个核苷酸缺失,不能表达完整多肽.     

陕北土壤芽胞杆菌种类分布多样性研究

为了解陕北土壤中芽胞杆菌的种类及其多样性,将采集于陕北5个地点的土壤样品利用温度筛选法、稀释平板计数法进行芽胞杆菌分离,用16S rDNA基因测序法进行种类鉴定。结果发现,从采集的土壤样品中共分离到31株芽胞杆菌,共19种芽胞杆菌,其中部分菌株为国内少见报道的菌株。通过16S rDNA基因序列的系统发育树分析发现,分离的菌株基本上和模式菌株亲缘关系较近,在种的系统发育上也存在一定的交叉,各菌株间序列差异较小。对土壤样品中芽胞杆菌多样性的研究中发现,不同土壤样品中的芽胞杆菌含量差异明显,表现为采自洛川毛主席故居土壤样品＞采自黄陵黄帝陵墓土壤样品＞采自宜川壶口瀑布土壤样品＞采自富县石泓寺土壤样品＞采自宝塔山宝塔下土壤样品,每个土壤样品中同种芽胞杆菌的含量差异也较明显,每个采集地点都含有特有的芽胞杆菌,说明陕北土壤中芽胞杆菌较丰富。     

新疆土壤芽胞杆菌采集鉴定及其分布多样性

为了解新疆芽胞杆菌的种类及其多样性情况,将采集于新疆4个地点的14份土样用稀释平板计数法进行芽胞杆菌分离,用MIDI鉴定系统和16SrDNA测序法进行种类鉴定。结果发现,从新疆土样中共分离到53株,13种芽胞杆菌,分别为巨大芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、嗜碱芽胞杆菌、粘性芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和萎缩芽胞杆菌。通过16SrDNA序列的系统发育树分析发现,分离的菌多数和模式菌株亲缘关系较近,也有少数几株菌与模式菌株亲缘关系较远,可能是由于芽胞杆菌属中各个种之间具有较近的亲缘关系,在种的系统发育上也存在一定的交叉,各菌株间序列差异较小。根据土壤中芽胞杆菌多样性研究发现,不同土壤标本内的芽胞杆菌含量差异显著表现为阿拉尔市>新疆喀什>阿克苏>塔克拉玛干沙漠。而每个地点中同种芽胞杆菌的含量差异也较显著,如:蜡样芽胞杆菌在阿克苏的含量为5.230×105 cfu.g-1,而在塔克拉玛干沙漠的含量仅仅为0.7×103cfu.g-1。新疆芽胞杆菌较丰富,不同地点芽胞杆菌在种类和数量上都有很大差异,每个地点都含有独特的芽胞杆菌。     

蜡状芽孢杆菌UD-8有机溶剂耐受特性的研究

菌体细胞内存在的与细胞结构和功能不相关的物质可以通过多物质抗性泵出系统运输排出细胞外。某些有机溶剂耐受菌可以通过泵出系统将细胞膜上及细胞内的有机溶剂分子泵出到细胞外。这些有机溶剂耐受菌通常表现出对抗生素耐受性的提高,通过测定细菌细胞抗生素耐受性可以测定其细胞内是否存在有机溶剂外排泵。为确定有机溶剂耐受菌株Bacillus cereus UD-8细胞内是否存在有机溶剂外排泵系统,分别研究了Bacillus cereus UD-8的有机溶剂耐受性;四环素、氯霉素、氨苄青霉素、林可霉素的抗药性及4种抗生素对Bacillus cereus UD-8的最小抑菌浓度。初步断定蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus UD-8可能具有有机溶剂泵出机制。     

新疆南疆羊蜱蝇基于12S rDNA,16S rDNA和18S rDNA基因的分子生物学鉴定

旨在建立羊蜱蝇的分子生物学鉴定方法,从新疆南疆库车县的绵羊体表采集样品,形态学鉴定初步确定为羊蜱蝇,随后进行羊蜱蝇12SrDNA、16SrDNA和18SrDNA基因的扩增和测序,将所得序列进行Blast在线分析和MEGA 5.0分析。结果表明,12SrDNA序列与云南2016年提交的相似性为100%,16S rDNA序列与丹麦2007年、捷克2017年和新疆2017年提交的相似性均为99%,18SrDNA序列与新疆2016年提交的相似性为99%。羊蜱蝇16SrDNA和18SrDNA序列均能与GenBank数据库中已知羊蜱蝇基因序列聚类,且羊蜱蝇种内K2P遗传距离为0～2.3%,通过12SrDNA、16SrDNA和18SrDNA基因的扩增和测序可准确鉴定羊蜱蝇。     

一株高产脂肪酶产生菌16S rDNA的序列分析

[目的]对分离获得的高产脂肪酶菌株进行鉴定,为其改造和更好利用奠定基础.[方法]对从食堂下水道中分离获得的一株高效产脂肪酶细菌(JLΠ-4)进行培养,提取其基因组DNA.设计16S rDNA通用引物,扩增16S rDNA基因片段,并连接到pUC19-T载体上,转化大肠杆菌DH5X,经PCR鉴定的阳性克隆摇菌培养后测序.[结果]提取获得较高质量的基因组DNA,扩增获得新分离菌株16S rDNA基因片段,长度为1528 bp,BLAST相似性比对分析结果表明,其与伯克霍尔德氏菌16S rDNA序列相似性达97%,是一株与伯克霍尔德氏菌最近的革兰氏阴性菌.[结论]初步将高产脂肪酶细菌JTΠ-4鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌.     

Differentiation Between Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus by 16S rDNA-PCR and ERIC-PCR

16S rDNA and ERIC （Enterobacteia Repetitive Intergenic Consensus Sequences） based on PCR method were tested for the effectiveness of the differentiation of B. thuringiensis and B. cereus. 16S rDNA-PCR primers were designed based on the sequence difference in variable regions of B. cereus 16S rDNA and B. thuringiensis 16S rDNA, 16S rDNA-PCR showed no obvious difference between B. cereus and B. thuringiensis. The only difference was that one 1600-bp amplificon could be obtained from all the three B. Cereus strains, and none amplificon from any B. thuringiensis strains. ERIC was optimized based on previous reports. The genonlic DNA was used for the template of ER1C-PCR, and the following DNA fingerprints were analyzed by the agarose gel electrophoresis. The results showed that DNA fingerprint of three B. thuringiensis strains had a unique amplicon less than 100-bp, while DNA fingerprint of three B. cereus＂ strains had none. Moreover, DNA fingerprint of B. cereus showed a 700-bp amplicon, but didn＇t have any DNA fingerprints ofB. thuringiensis genome. Therefore, ERIC-PCR technique should be able to be used for the differentiation of B. thuringiensis and B. cereus.     

基于16S rDNA序列4株鸡源芽孢杆菌的分子鉴定

对分离自肉鸡肠胃的4株芽孢杆菌R1、R2、S1、H1的16S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,在NCBI中通过Nucleotide BLAST查找其同源序列,应用DNAstar的MegAlign软件中的Jotun Hein、Clustal V 、Clustal W3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega5.0软件中的最大似然法、邻接法、最小进化法、最大简约法构建系统发育树.序列差异和同源性分析结果显示:由Jotun Hein法可知,H1和R2与Bacillus subtilis DSM10同源性最高,达到100％;R1与B.vallismortis DSM11031同源性最高,达到99.7％;H1与B.subtilis DSM10的同源性为99.9％.由Clustal V法可知,H1与R2同源性最高,达到99.6％;R1与S1同源性最高、为98.7％.由Clustal W法可知,H1与R2同源性最高、为99.7％,R1与S1为99.4％.采用4种方法构建的系统发育树基本一致,可以确立4株鸡源芽孢杆菌的分类地位,R1、S1与B.subtilis BPRIST009、B.subtilis LXB3、B.vallismortis DSM11031之间关系最为亲近;R2、H1与B.subtilis CICC10076、B.subtilis DSM10之间关系最为亲近.     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

广东茄科雷尔氏菌16S rDNA序列分析

应用PCR方法,获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香共12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S rDNA.序列测定及比较结果表明,21个广东茄科雷尔氏菌菌株16S rDNA近全长序列均为1 528 bp,序列间同源率99.2%～100%;各菌株的16S rDNA序列间只有1～12个不等的碱基差异,其中20个菌株的458～460位及474位的碱基是ACT和T,而菌株HZ-1则是TTC和A,说明广东茄科雷尔氏菌的16S rDNA序列十分保守.系统进化分析结果显示,仅菌株HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌2a亚组中,其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中.     

柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析

采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化分析及限制性内切酶XbaI酶切结果表明,顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型.不同类型柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列差异性分析表明,亚洲种与非洲种的差异性为2.75％,非洲种与美洲种的差异性为3.90％,亚洲种与美洲种的差异性为3.44％.     

具有溶磷能力的相思根瘤菌16S rDNA序列分析

为了测定具有溶磷能力的相思根瘤菌的16S rDNA序列。在TY培养基上将菌株培养至对数生长期,以提取的总DNA为模板,采用双向引物进行PCR扩增,对获得的目的产物进行纯化和测序。采用PHYLIP软件中DNADIST程序分析各菌株间的相似性,采用Clustal X和Treeconw软件获得菌株的系统发育树状图。系统发育学分析表明:G7-3、G31-1-5、G31-1-10位于根瘤菌属(Rhizobium)分支中;F7-2-11位于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)分支;DH001、LH001、LL007酸、Y木1F、3-2-6位于Mesorhizobium分支中;H1-1-1属于类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)。该研究初步确定了具有溶磷能力的相思根瘤菌菌株的发育学地位。     

草本纤维提取用菌株的PCR-16S rDNA及ITS-RFLP分析

通过分析从沤麻水中分离到的8株草本纤维提取用菌株的16S rDNA以及ITS序列,鉴定并构建其聚类图,明确草本纤维提取用菌株的遗传关系.通过BLAST比对16S rDNA并用限制性内切酶酶切16～23S的ITS保守序列,对参试菌株的16S rDNA及ITS酶切片段进行聚类分析.结果表明,8株菌株分别属于地表芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及多粘类芽孢杆菌:基于16S rDNA序列与ITS-RFLP所获得的聚类结果基本一致,菌株1251与菌株1172-1聚为一类,其余聚为一类,但种内聚类存在一定的差异,可能与不同类型的序列进化程度有关,8株菌株的16SrDNA序列的相似性为78.66%;Alu Ⅰ、Hinf Ⅰ、Sau3A Ⅰ、Taq Ⅰ 4种限制性内切酶对参试的8株草本纤维提取用产芽孢菌株的ITS进行酶切,各获得0～4条100～440bp的酶切产物.     

用16S rDNA序列分析方法鉴定4个拮抗细菌

用1对16SrDNA通用引物，对4个拮抗细菌96-38、96-41、96-79和9682的基因组DNA进行扩增，PCR产物经克隆、测序、同源性分析表明，这4个菌株的16SrDNA全长均为1513bp，同源性达99．79％，仅在13个碱基位点存在差异。Blast分析发现，这些菌株与Genbank收录的芽孢杆菌属5个菌株16SrDNA序列的同源性为99．1％～99．9％，由此推断这4个拮抗细菌为芽孢杆菌属细菌。     

一株芽孢杆菌16S rRNA的基因序列测定和系统进化分析

从河南黄河稻区土壤中分离出一株具有较强稻瘟病菌拮抗活性的芽孢杆菌菌株BS501,经过形态观察、生理生化特性检测和电镜技术,确定其为芽孢杆菌属细菌,为进一步确定其分类学地位,扩增了 BS501基因组的16S rDNA.并将测序结果提交GenBank数据库(登录号:FJ755787).利用BLAST软件将该序列与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢菌属细曲及大肠杆菌16S rDNA序列进行同源性比对.系统进化树表明,BS501与芽孢菌属细菌存进化关系上组成一个大的分支,与枯草芽孢杆菌最为接近,与大肠杆菌较远.同源性分析表明该序列与枯草芽孢杆菌PRE23同源性达99%,证实该菌株的分类学地位为枯草芽孢杆菌.     

黄喉拟水龟松鼠葡萄球菌16S rDNA的序列测定和系统进化分析

从患病的黄喉拟水龟肝脏、肾脏分离到1株葡萄球菌（YLD81101）,经人工感染实验证实其为该病的病原菌。为了从分子水平上对其进行分类学鉴定,采用扩增细菌16S rDNA的通用引物对该菌的16S rDNA进行PCR扩增、克隆及序列分析。结果扩增出长约1．5kp的目的片段,测序得到1条长度为1515bp的核苷酸序列（GenBank登录号GQ261178）。核苷酸相似性分析表明,所得序列与GenBank公布的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciud,S．sciuri）CTSP9菌株16S rDNA核苷酸序列相似性最高（99．9％）。同时,用与该序列相关性较高的S．sciuri及常造成动物葡萄球菌病的S．aureus S、saufeuss．bsp．anaerobius、S.gallinarum、S.hyicus代表菌株构建的系统发育进化树显示,菌株YL081101与S.sciuri代表株聚为一簇。上述研究证实,分离菌株YL081101为松鼠葡萄球菌。