养猪发酵床微生物宏基因组基本分析方法

养猪微生物发酵床分解猪粪、消除恶臭,将猪粪形成生物菌肥,实现了养猪污染的微生物治理和猪粪的资源化利用,微生物起到关键作用。然而,关于发酵床微生物群落的种类、数量、结构等方面系统研究鲜见报道。课题组采用高通量宏基因组学方法,系统地开展了微生物发酵床的微生物组研究,揭示不同空间、不同深度、不同发酵程度、不同垫料组成、不同季节发酵床中的微生物组成及其区系演替规律。本文就相关的宏基因组测序的样本采集、样本处理、测序原理、分析模型、数据统计、结果表述等分析流程和方法进行了归纳,阐明微生物组操作分类单元(OTU)鉴定,物种累积曲线,核心微生物组,种类丰度主成分分析,种类秩-多度曲线,物种组成丰度柱状图、热图、星图等分析的原理与方法,列举微生物组种类复杂度α-多样性分析、β-多样性分析、种类显著性差异LEfSe分析,冗余分析等实例,为深入研究发酵床微生物群落提供了完整的分析思路和范例。     

温泉土壤宏基因组文库构建及普鲁兰酶筛选

[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200（含2％ PVPP）凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）,其次为恐球菌—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和变形杆菌门（Proteobacteria）.用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础.     

宏基因组技术及其应用研究进展

传统培养方法从环境中只能获得1%左右的微生物,而宏基因组技术作为一种不依赖于培养的新理念和新方法,可以克服上述瓶颈,使从探究环境中获得大量未能培养的微生物成为现实.宏基因组技术于10年前诞生,至今已取得了令人瞩目的进展.对宏基因组学的概念、方法和应用等方面进行了综述,以期为同类研究提供参考.     

山羊瘤胃微生物宏基因组文库中一个新型纤维素酶 基因的克隆与表达

通过功能筛选方法,从安徽白山羊瘤胃微生物宏基因组文库中筛选得到了6个纤维素酶的阳性克隆。对其中的1个阳性克隆进一步进行亚克隆和序列分析,获得一个新型纤维素酶基因开放阅读框,通过BLAST对基因全序列进行分析比较,发现其与来自Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838的hypothetical protein具有51%的序列相似性和65%的同源性。并以p ET28a(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌,对新型酶基因进行高效重组表达,并对该酶表达条件进行优化。     

西北高海拔地区放养偶蹄类动物肠道微生物多样性的宏基因组比较研究

[目的]分析西北高海拔地区偶蹄类动物肠道的微生物多样性。[方法]从动物粪便样品中提取全部微生物的DNA,利用宏基因组学方法,通过高通量测序及生物信息学分析对肠道微生物多样性及群落功能进行比较。[结果]在相似的地理环境下,不同物种偶蹄类动物的肠道微生物多样性存在高度的相似性,暗示着生存环境对动物肠道微生物的多样性发挥着重要影响。[结论]该研究初步阐明了西北地区高海拔环境下不同种类动物的肠道微生物多样性,为进一步了解高原环境中微生物的构成提供了重要参考。     

宏基因组解析溴氰虫酰胺对小菜蛾肠道菌群结构的影响

【目的】探究溴氰虫酰胺胁迫对小菜蛾肠道酶活、微生物菌群、相关功能基因及抗性基因的影响,为双酰胺类杀虫剂处理小菜蛾肠道微生物的结构和功能研究提供参考。【方法】采用宏基因组测序技术研究浓度为0.15 mg/L溴氰虫酰胺浸叶饲喂小菜蛾后其肠道微生物群落结构及其功能的变化情况。【结果】溴氰虫酰胺浸叶饲喂后小菜蛾肠道中羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性显著增高,而多功能氧化酶活性显著降低。溴氰虫酰胺未处理与处理小菜蛾肠道的微生物分别注释到34和35个门、66和64个纲、120和125个目、200和214个科、261和294个属、347和401个种,其中微孢子门(Microsporidia)、厚壁菌门(Firmicutes)为处理与对照组的共有优势菌门,小孢子虫属(Nosema)、肠球菌属(Enterococcus)为处理组与对照组的共有优势菌属,但溴氰虫酰胺处理后2种优势菌属的相对丰度均有降低。小菜蛾肠道微生物在eggNOG与KEGG数据库中分别注释到11 682和6437个功能基因,分布于水化合物转运与代谢、翻译后修饰、蛋白质翻转、遗传信息处理等功能类群;在CAZy和CARD数据库中分别注释到...     

基于肠道宏基因组对弹涂鱼两栖适应性的研究

【目的】从基 因组水平上报道两种有代表性的两栖鱼类大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris, BP）和大鳍弹涂鱼（Periophthalmus magnuspinnatus,PM）对陆地生活的适应性,以揭示胃肠道微生物群对弹涂 鱼在陆地生活的适应性及其特殊免疫力具有关键作用。【方法】采用 16S 扩增子测序和宏基因组技术,利用两种 有代表性的弹涂鱼和 3 种典型水生鱼类（草鱼 Ctenopharyngodon idellus、鲢鱼 Hypophthalmichthys molitrix 和鳙鱼 Aristichthys nobilis）的宏基因组数据,比较两栖鱼类和水生鱼类肠道的微生物组成、多样性、丰度和功能,并研 究潜在陆生标志微生物群。此外,通过查阅大量文献得到具有代表性的海水鱼类、淡水鱼类、两栖动物和陆生动 物的胃肠道微生物群数据,比较弹涂鱼的肠道菌群组成和功能。【结果】在弹涂鱼的胃肠道微生物群中,厚壁菌门、 变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门占主导地位。这些菌的含量在大鳍弹涂鱼、大弹涂鱼和水生鱼类之间存在显著差 异。草鲢鳙和弹涂鱼二者胃肠道微生物群之间最大的区别是 CKC4 门（一种推测与宿主脂质代谢相关的胃肠道细 菌门类）的比例,草鲢鳙中该比例从 4％ ~27％不等,而在弹涂鱼中则没有发现。此外,弹涂鱼的胃肠道微生物 群中同时具有陆生动物、淡水和海水鱼类以及两栖动物的典型细菌家族,这与它们在水陆过渡咸淡水交界处的生 活特征相吻合。与陆生动物相比,鱼类拥有更高比例的梭状杆菌和变形杆菌,而陆生动物则具有更多的拟杆菌。 在大弹涂鱼和大鳍弹 涂鱼中还发现了此前被认为仅存在于陆生动物的 S24-7 菌株。【结论】推测弹涂鱼胃肠道微 生物群落相比水生性鱼类具有复合和多样性特征,可以通过病原体相关分子模式 PAMP 刺激宿主在进化中形成多 样性更高、拷贝数更多的天然免疫受体基因家族,以此适应更为复杂的两栖生活环境。     

宏基因组在动物肠道微生物中的应用研究进展

肠道微生物与机体之间始终保持着一种动态平衡的关系,它们不仅在机体的消化吸收方面发挥作用,而且在机体免疫、营养物质代谢等方面起着重要调节作用。近年来,随着宏基因组研究的快速发展,人们利用宏基因组在动物肠道菌群上进行了广泛研究,肠道微生物菌群结构及其在生理代谢途径中发挥的作用在此基础上得到了更全面的认识。综述宏基因组在肠道微生物方面的研究进展,旨在为动物生产相关领域的研究提供参考。     

叶围微生物宏基因组文库的构建和分析

宏基因组文库技术是开发利用未培养微生物基因资源的有效途径。采用CTAB-SDS法直接从植物叶面沉积样品中提取基因组DNA,构建了以puc19为载体的基因组文库,共获得8126个阳性克隆,文库DNA总容量约30.1MB,平均插入片段长度为3.8kb。叶围微生物基因组文库的成功构建,对于以后研究植物和叶围微生物的关系有重要意义。     

稻瘟病抗性鉴定田土壤宏基因组文库构建及分析

从稻瘟病抗性鉴定田中提取土壤微生物宏基因组DNA,EcoRⅠ和BamHI双酶切后插入到经同样双酶切的pSK 载体中,转化至DH5α感受态细胞,构建了土壤微生物宏基因组文库。随机挑选了9个克隆测序,并通过NCBI的Blastx分析了序列可能所属的物种和基因。结果其中有6个能与库中序列达到较大匹配,3个的分析结果表明可能是新基因,说明所建文库的生物多样性和新基因数较丰富。     

Screening and characterization of a novel ruminal cellulase gene(Umcel-1) from a metagenomic library of gayal(Bos frontalis)

Gayal is a rare semi-wild bovine species found in the Indo-China.They can graze grasses,including bamboo leaves,as well as reeds and other plant species,and grow to higher mature live weights than Yunnan Yellow cattle maintained in similar harsh environments.The aim of this study was to identify specific cellulase in the gayal rumen.A metagenomic fosmid library was constructed using genomic DNA isolated from the ruminal contents of four adult gayals.This library contained38400 clones with an average insert size of 35.5 kb.The Umcel-1 gene was isolated from this library.Investigation of the cellulase activity of 24 random clones led to the identification of the Umcel-1 gene,which exhibited the most potent cellulase activity.Sequencing the Umcel-1 gene revealed that it contained an open reading frame of 942 base pairs that encoded a product of 313 amino acids.The putative gene Umcel-1 product belonged to the glycosyl hydrolase family 5 and showed the highest homology to the cellulase（GenBank accession no.YP₀04310852.1）from Clostridium lentocellum DSM 5427,with 44%identity and 62%similarity.The Umcel-1 gene was heterologously expressed in Escherichia coli BL21,and recombinant Umcel-1 was purified.The activity of purified recombinant Umcel-1 was assessed,and the results revealed that it hydrolyzed carboxymethyl cellulose with optimal activity at pH 5.5 and 45℃.To our knowledge,this study provides the first evidence for a cellulase produced by bacteria in gayal rumen.     

Isolation of single-copy human genes from a library of yeast artificial chromosome clones

A recently developed cloning system based on the propagation of large DNA molecules as linear, artificial chromosomes in the yeast Saccharomyces cerevisiae provides a potential method of cloning the entire human genome in segments of several hundred kilobase pairs. Most application of this system will require the ability to recover specific sequences from libraries of yeast artificial chromosome clones and to propagate these sequences in yeast without alterations. Two single-copy genes have now been cloned from a library of yeast artificial chromosome clones that was prepared from total human DNA. Multiple, independent isolates were obtained of the genes encoding factor IX and plasminogen activator inhibitor type 2. The clones, which ranged in size from 60 to 650 kilobases, were stable on prolonged propagation in yeast and appear to contain faithful replicas of human DNA.     

瘤胃微生物基因组文库中BAC末端序列分析

基于前期从瘤胃微生物基因组文库中筛选的功能酶克隆菌,利用T7和pIBRP引物,测定功能酶克隆菌的BAC末端序列,并利用NCBI Blast系统对BAC末端序列进行分析.结果表明:共得到26条BAC末端序列,经Blast比对分析,与已知编码基因的匹配度低,而大部分BAC末端序列与阪崎肠杆菌和环境中的微生物匹配度高,说明瘤胃中的微生物与其它环境中的微生物具有一定的相似性,进一步丰富了对瘤胃微生物的认识.     

基于Fosmid文库筛选山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因及其表达验证

【目的】利用Fosmid文库功能筛选法,获得山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因并进行原核表达。【方法】利用功能底物筛选法从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选具有蛋白酶活性的克隆子,对其进行Illumina二代测序,对预测到的基因进行功能注释,根据基因丰度结果确定后续研究的功能基因。利用大肠杆菌BL21(DE3)对功能基因进行诱导表达,对表达产物进行酶活性测定。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,将密码子优化后的功能基因分别敲入枯草芽孢杆菌C6基因组ctc位点并进行表达验证。【结果】从Fosmid文库1 700个克隆子中筛选到1个具有蛋白酶活性的阳性克隆Pro4-C5。通过二代测序技术,鉴定出3个潜在的蛋白酶基因gene0833（内肽酶,EC编号：EC3.4.21.53）、gene0196（金属内肽酶,EC编号：EC3.4.24）和gene0585（羧肽酶,EC编号：EC3.4.17.14）以及1个L-天冬酰胺酶基因（gene0683,EC编号：EC3.5.1.1）。以pET-28a(+)为表达载体,通过大肠杆菌BL21(DE3)原核诱导表达发现,gene0585和gene0196未表达;gene0833表达的蛋白分子质量为87 ku,蛋白酶活性为10.45 U/mL;gene0683表达的蛋白分子质量为37 ku,L-天冬酰胺酶活性为88.52 U/mL,同时发现该蛋白也具有蛋白酶活性,酶活性为5.25 U/mL。将密码子优化后的gene0683和gene0833定点敲入枯草芽孢杆菌C6基因组中表达发现,gene0833未表达,gene0683表达的蛋白酶活性为109.72 U/mL,相比原始菌株（100.97 U/mL）显著提高了8.67%（P＜0.01）;L-天冬酰胺酶活性为31.63 U/mL,相比原始菌株（22.79 U/mL）显著提高了30.06%（P＜0.01）。【结论】从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选和鉴定出了2个具有蛋白酶活性的功能基因（gene0833和gene0683）,均来源于微小杆菌属（Exiguobacterium）,其中gene0683在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达产物具有较高的蛋白酶和L 天冬酰胺酶酶活性。     

斜带石斑鱼幼鱼消化道与养殖水体中可培养菌群的研究

利用海水琼脂、TCBS和MRS培养基对斜带石斑鱼Epinephelus coioides幼鱼消化道和养殖水体中的细菌进行分离纯化,采用生理生化鉴定结合16SrRNA基因测序进行细菌鉴定,探讨了幼鱼消化道中的菌群与养殖水体中菌群的关系。结果表明：幼鱼消化道中可培养细菌总数（9．0×106cfu／g）高于养殖水体中可培养细菌总数（5．4×105cfu／mL）,幼鱼消化道中细菌种类也明显多于养殖水体;在幼鱼消化道和养殖水体中均检测到副溶血弧菌、哈维氏弧菌、短小芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、鲍氏不动杆菌、嗜冷杆菌和洋葱伯克霍尔德菌等7种细菌。细菌系统进化分析结果表明,这些细菌隶属于β-变形杆菌纲、γ-变形杆菌纲和芽孢杆菌纲。幼鱼消化道和养殖水体的优势菌中均有芽孢杆菌和嗜冷杆菌,提示芽孢杆菌和嗜冷杆菌能通过养殖水体很好地进入消化道。3种乳酸菌（乳酸乳球菌、干酪乳杆菌和屎肠球菌）仅见于幼鱼消化道,且仅占消化道菌群数量的0．70％。弧菌在消化道和养殖水体中所占比例均很小,分别仅占细菌总数的1．07％和0．10％。     

基于Web of Science数据库的犬猫肠道菌群研究热点的可视化分析

为全面、客观分析犬猫肠道菌群研究的发展脉络和热点方向,本研究采用文献计量学方法,检索Web of Science核心数据库近20年关于犬猫肠道菌群的文章,应用软件Citespace、VOSviewer和Microsoft Excel对发文量、发文时间、发文国家和机构、发文作者、发文期刊、文献共被引频次和关键词进行分析。结果表明：1）在犬猫肠道菌群领域,近20年Web of Science共发表相关文献413篇,且发文量呈逐年上升趋势。2）美国得克萨斯A&M大学是发文最多的机构,形成了以学者Suchodolski和 Swanson为核心的学术共同体;PLOS ONE是发文量最多的期刊。3）研究方向可分为4方面,分别是营养素对犬猫肠道菌群的影响、益生菌对犬猫肠道菌群的影响、疾病和犬猫肠道菌群紊乱的相关性以及肥胖和犬猫肠道菌群的相关性。犬猫食物补充剂如何通过调控肠道菌群进而提高健康水平是未来研究的关注重点。综上,近年来犬猫肠道菌群相关研究正逐步受到研究者的关注,本研究为改善犬猫的健康水平和生活质量提供重要的参考依据。     

燕麦抗动脉粥样硬化作用的研究进展

燕麦是全世界种植和食用的古老粮食作物之一,β-葡聚糖是燕麦中的主要活性化合物,燕麦还含有大量其他生物活性化合物,如酚酸、生育酚、燕麦蒽酰胺等。血浆中胆固醇水平升高、炎症反应和脂蛋白的氧化是动脉粥样硬化的特征。燕麦具有降低血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的作用,并且还具有抗炎、抗氧化以及保护内皮功能的作用;燕麦能够通过改善肠道菌群促进短链脂肪酸产生,加速胆固醇向胆汁酸的转化以降低全身胆固醇水平。研究证明,燕麦具有抗动脉粥样硬化的功效。对燕麦抗动脉粥样硬化作用进行综述,以期对后续研究提供参考。