感染溶藻弧菌对日本蟳肝胰腺免疫功能的影响

摘 要：为探讨日本蟳感染溶藻弧菌的致病机理,采用溶藻弧菌人工感染健康日本蟳,分析了感染前后日本蟳肝胰腺 PO、SOD和LSZ活性变化及注射免疫多糖后的免疫保护率,并研究了细胞超微结构的病理组织学。结果表明：日本蟳感染溶藻弧菌后,肝胰腺中PO、SOD和 LSZ的活性均受到不同程度的影响,感染6~12 h,3种酶的活性均有一个上升的过程,但之后随时间的延长呈现下降趋势;免疫感染组因感染弧菌前注射了免疫多糖,日本蟳肝胰腺中PO、SOD和LSZ酶活性均显著高于感染组的酶活性,感染7 d后的免疫保护率高达72.73％,表明免疫多糖可提高酶的活性,使机体的抗病菌能力增强。超微结构显示：对照组日本蟳肝胰腺细胞结构形态正常,上皮细胞表面的微绒毛排列整齐,各细胞器结构完整;免疫组内质网、糖原颗粒和线粒体丰富,微绒毛排列致密;感染组肝胰腺组织受到明显的损伤,细胞和部分微绒毛脱落、受损;线粒体和粗面内质网变形、水肿或仅剩一空泡;核高度异染色质化,核膜破裂。与感染组相比,免疫后感染组具有形态结构较正常的细胞核、整齐致密的微绒毛和丰富的溶酶体,但依然可见水肿的内质网和狭长畸变的线粒体。     

鳗弧菌感染对日本鑚部分免疫活性因子的影响

对日本蟳(Charybdis japonica)进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)悬液和生理盐水(对照)注射感染,研究其血清免疫因子超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)活性的变化,并对试验结果进行统计学分析。结果表明,注射鳗弧菌悬液组SOD活性12、24、48h均高于对照组,48h达到最高;CAT活性12、24h增加非常明显,12h达最高;AKP活性5、12、24h都有增加,均高于对照,24h最高;ACP活性12h开始上升,24h达最高。在人工感染鳗弧菌48h内,日本蟳体内的免疫因子发生了明显的变化,血清中SOD、ACP、AKP、CAT活性在不同时间段均有显著升高趋势,高于对照组水平。     

盐度对日本蟳免疫生理指标及消化酶活力的影响

15℃下测定了不同盐度(15、20、25、30、35)对体质量(87.22±20.71)g的日本蟳免疫相关指标(血细胞密度、血蓝蛋白含量、酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力、过氧化代谢产物丙二醛含量)和中肠腺消化酶(酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶)活力的影响。试验结果表明,血细胞密度与盐度呈正相关,盐度对血蓝蛋白含量无显著影响。盐度30组的酚氧化酶活力、盐度20和30组的溶菌酶活力先升后降,而盐度15、20和35组的酚氧化酶活力、盐度15和35组的溶菌酶活力先降后升再降。至处理第5d,各试验组的酚氧化酶与溶菌酶的活力为:盐度2520301535。盐度变化后,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力均表现为先升后降,而丙二醛含量先降后升,至处理第5d,以盐度15和35组的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力较低,而丙二醛含量显著高于其他试验组(P0.05)。盐度20组的淀粉酶与纤维素酶活力最高,盐度25组的酸性蛋白酶和脂肪酶活力最高,盐度30组的碱性蛋白酶活力最高,而盐度15组的5种消化酶活力均为最低。盐度20～30为日本蟳较适宜的环境条件,而盐度15与35条件下会引起其免疫能力和消化酶活力的明显降低。超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量长期变化情况可作为衡量日本蟳在盐度变化下免疫状态的指标。     

亚硝态氮胁迫对日本蟳免疫指标的影响

15℃下将体质量(85.51±16.18)g的日本蟳暴露于对照及低质量浓度(2.0、4.0mg/L)、中质量浓度(6.0mg/L)和高质量浓度(8.0、10.0mg/L)的亚硝态氮中,于胁迫的第1、3、5、10、15d取血,测定其免疫的相关指标,以研究亚硝态氮质量浓度对日本蟳免疫功能的影响。试验结果表明,在亚硝态氮胁迫下,所测指标均呈"先升后降"的趋势。在胁迫第1d,各试验组的血细胞密度、血蓝蛋白含量及溶菌酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力均大于对照组,而高质量浓度组的酚氧化酶活力低于对照组。随着亚硝态氮胁迫时间的延长,低质量浓度组血细胞密度和溶菌酶活力上升较快,而高质量浓度组酚氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力上升较快。低质量浓度组的血细胞密度和过氧化氢酶活力升高幅度较大,高质量浓度组的血蓝蛋白含量及酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶活力升高幅度较大。胁迫第10d,各试验组溶菌酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力显著低于对照组(P<0.05)。胁迫第15d,低质量浓度组血细胞密度、2.0mg/L组的血蓝蛋白含量、低质量浓度组和中质量浓度组的酚氧化酶活力略大于对照组,其他各指标所测结果均低于对照组。各试验组溶菌酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶胁迫后活力与亚硝态氮胁迫质量浓度呈负相关,10.0mg/L组的3种酶活力分别比对照组降低95.41%、36.84%和77.78%。     

副溶血弧菌感染日本蟳后对几种免疫活性酶的影响

用副溶血弧菌悬液和生理盐水(对照)注射感染日本蟳,研究其血清超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)活性的变化,并进行统计学分析。试验结果表明,注射副溶血性弧菌悬液组12、24、48 h后SOD活性均高于对照组,48 h达到最高;122、4 h CAT活性增加明显,24 h达最高;AKP活性5、12、24 h均有增加,高于对照组,24 h最高;ACP活性12 h开始上升,24 h达最高。在人工感染副溶血性弧菌48 h内,日本蟳体内的免疫因子发生明显的变化,血清中SOD、ACP、AKP、CAT活性在不同时间段均有显著升高趋势,高于对照组。     

注射溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫功能的影响

应用溶藻弧菌疫苗注射南美白对虾,测定了弧菌疫苗对南美白对虾免疫指标的影响以及疫苗的免疫保护作用。结果表明,注射溶藻弧菌疫苗后,血清凝集效价增强,24 h时活力达到最高值,尤其是1.08×108cell/ml组的凝集效价升高最明显,为对照组的6.0倍;在24 h时,3个试验组的凝集效价均明显高于对照组(P<0.05)。溶菌活力注射后6 h即达到最高值,1.08×107、1.08×108cell/ml组的溶菌活力明显高于对照组(P<0.05)。抗菌活力在注射后3 h时最高,明显高于对照组。溶血活力在注射疫苗后有所增强,注射后6 h时1.08×106、1.08×107cell/ml组的活力达到最高,而1.08×108cell/ml组12 h时活力达到峰值。注射疫苗对血清超氧化物歧化酶活力基本没有影响。1.08×106、1.08×107、1.08×108cell/ml对南美白对虾的免疫保护率分别为46.3%、61.0%和75.6%。     

溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护试验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110～150g的大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1&#215;109cfu/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示,第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。     

漂白粉蓄积对日本蟳4种组织超微结构的影响

根据急性毒性试验确定了漂白粉对日本蟳的安全质量浓度为0．6mg／L，采用透射电镜技术研究了该质量浓度下漂白粉蓄积对日本蟳4种组织细胞(肌肉、鳃、肝胰脏和心脏)超微结构的影响。试验结果表明：漂白粉主要损伤日本蟳的鳃和肝胰脏，其次是心脏，肌肉基本无损害。鳃细胞的损害表现为鳃丝水肿，细胞器溶解，角质层变薄，线粒体、内质网的肿胀、解体；肝胰脏细胞的主要损害特征为肝管微绒毛减少、线粒体水肿解体、内质网扩张、细胞核空泡化、核膜水肿、脂肪滴增加；心脏细胞的毒理变化为线粒体内嵴肿胀、瓦解，肌原纤维不规则，内质网溶解。安全质量浓度的漂白粉经16d蓄积后，虽没有导致日本蟳死亡，但已对其体内的鳃、肝胰脏、心脏等组织细胞的超微结构产生了不同程度的影响。     

溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护实验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110~150g大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1×109CFU/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示:第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。     

日本蟳胚胎发育的初步观察

对日本胚胎发育进行了观察。日本卵子为中黄卵,受精卵起初为螺旋型等裂,以后趋向表面卵裂,形成边围囊胚。原肠作用以外包、集中和内陷的方式进行。原肠胚形成后,再经第一期膜内无节幼虫、第二期膜内无节幼虫、第一期膜内蚤状幼虫、第二期膜内蚤状幼虫等阶段,最后破膜,孵出第一期蚤状幼虫。水温23．4－26．3℃,从卵子产出到破膜孵出,历时约13d（天）。     

A selective and differential medium for Vibrio alginolyticus

In this paper, we present a selective and differential medium, termed Vibrio alginolyticus (VAL) agar, developed for the isolation and identification of V. alginolyticus. The presence of bile salts, high salinity and high incubation temperature allows the selective growth of moderately halophilic Vibrio species. Differentiation of bacteria is achieved by identifying species capable of sucrose fermentation, made visible by the pH indicator bromocresol purple. In this study, all of the 26 strains of V. alginolyticus and only three of the 99 strains representing 30 species (including 19 Vibrio species) other than V. alginolyticus were able to grow in the VAL medium. The remaining three strains could be further differentiated from V. alginolyticus according to colour or the diameter of colonies produced on VAL agar plates. Colonies isolated from shellfish rearing water and infected shrimp through the use of VAL agar plates were all positively identified as V. alginolyticus by conventional tests and 16S rDNA sequencing. The testing of specificity and differentiation capability of VAL shows the potential of the agar as a medium for the primary isolation of V. alginolyticus from pathological and environmental samples.     

不同环境条件对溶藻弧菌粘附大黄鱼肠粘液的影响

在低盐度5~6和水温25~29℃条件下,分别投喂1种对照饲料和7种添加二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)(添加量分别为100、2003、00、400、5006、00和700mg.kg-1)的试验饲料,饲养初始体重约每尾0.77g的凡纳滨对虾56d,观察DMPT对凡纳滨对虾的生长、蜕壳和渗透压调节的影响。实验结果表明,添加DMPT的各组凡纳滨对虾增重率随着DMPT添加量的增加,呈现先升后降的趋势,在400mg.kg-1凡纳滨对虾增重率达到最高,显著高于对照组;与对照组相比,各试验组凡纳滨对虾的饲料系数均不同程度降低,500mg.kg-1DMPT组凡纳滨对虾的饲料系数降低达到显著水平。添加DMPT对凡纳滨对虾的蜕壳次数无显著影响。除100mg.kg-1DMPT组外,DMPT组凡纳滨对虾的渗透压均明显低于对照组,其中,添加300和500mg.kg-1组凡纳滨对虾的渗透压降低呈现显著性差异。凡纳滨对虾肌肉粗蛋白和粗脂肪含量随着DMPT水平增加呈现出先上升后下降的趋势。粗蛋白含量在DMPT添加量为400mg.kg-1时达到最高,粗脂肪含量在DMPT添加量为600mg.kg-1时达到最高,均显著高于对照组。以增重率为判定指标,DMPT在凡纳滨对虾饲料中的适宜添加量为383mg.kg-1。     

致病性溶藻弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法研究静置培养条件下致病性溶藻弧菌ND-01在酶标板上成膜情况。结果显示,溶藻弧菌的生物膜的OD590在16h达到峰值后,随培养时间延长出现下降;在102～108cfu/mL范围内,不同的初始菌密度对生物膜的OD590影响并不显著;NaCl质量分数为4.5%时,所形成生物膜的OD590最高;30℃,溶藻弧菌的生物膜OD590显著高于其他温度组(P0.05);在胰蛋白胨大豆肉汤培养液中加入质量分数1.5%的CaCl2,能够显著促进生物膜形成,而加入MgCl2对于生物膜的影响则不显著;经过大黄鱼表皮黏液包被后,96孔板中生物膜的OD590显著高于其他部位组织提取液包被组(P0.01)。致病性溶藻弧菌ND-01能够在聚苯乙烯材料的96孔酶标板表面形成稳定而明显的生物膜,且其生物膜的形成与多种环境因素有着密切关系。     

日本蟳精子超低温冷冻保存技术的研究

以精子存活率作为评价指标,采用两步降温法研究了稀释剂、抗冻保护剂和预冷时间对日本蟳精子超低温冷冻保存效果的影响。结果表明:以采用稀释剂II、15%二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻保护剂的保存效果最佳。在液氮中保存24 h后,精子存活率可达83.76%,保存一年后可达73.81%。精液的第一次预冷时间以25 min为宜。     

不同环境条件对溶藻弧菌粘附大黄鱼肠粘液的影响

研究了不同环境条件下溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附作用。采用细菌计数法测定溶藻弧菌的粘附作用。粘附的细菌经SYBR GreenⅠ染色后在荧光显微镜下观察,用数码相机拍照后在电脑上计数。试验结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附量随菌浓度的升高而升高,并在1—1．5h内趋于饱和;粘附作用在15—30℃、pH偏酸时较强;盐度在5—35范围内对前肠粘液的粘附作用影响不明显,后肠粘液的粘附作用在此范围内随盐度增大而加强,在盐度为0时,溶藻弧菌对前、后肠粘液都无粘附作用;56℃热处理5min及60℃处理1h均能大幅减弱溶藻弧菌对两种肠粘液的粘附作用,表明溶藻弧菌表面的某些热敏结构在粘附作用中起着重要作用。根据以上结果,可以认为溶藻弧菌能够很好地粘附于大黄鱼肠粘液层,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子影响很大,溶藻弧菌表面的某些热敏结构可能在粘附过程中起着重要作用。研究结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附作用是可控制的,这对于鱼类养殖疾病的控制有一定的参考价值。     

三唑磷蓄积对日本[虫寻]体内保护酶系统的影响

首先根据急性毒性试验确定了三唑磷对日本蟳的安全浓度为0·27mg·L-1,然后研究三唑磷蓄积对日本蟳体内5种组织保护酶系统的影响。结果表明:(1)日本蟳体内的保护酶系统由SOD和CAT组成,在所有检测的组织中都没有发现POD的存在。(2)SOD和CAT的活性显示出高度的组织特异性,按SOD活性从高到低排列的顺序为:心脏>鳃和肌肉>性腺和肝胰脏,CAT活性大小顺序为:性腺>肝胰脏>心脏>鳃>肌肉。(3)日本蟳体内的保护酶在三唑磷作用下发生了相应的变化,低水平的胁迫能对酶产生一定的刺激作用,而高度的胁迫会抑制酶的活性。(4)不同组织对药物的敏感性不同,鳃、肝胰脏和性腺的敏感性大于心脏和肌肉。     

梭子蟹溶藻弧菌病的初步研究

2005～2006年,昌邑池塘养殖梭子蟹发生被称为"牙膏病"的疾病,并导致大量死亡。发病时间主要在7～9月份的高水温期,病蟹典型症状是肌肉白浊、无弹性、呈不透明的乳白色。从病蟹的肌肉、肠道、胃、眼球、肝胰腺均分离到单一形态的微生物,经生理生化鉴定为溶藻弧菌。人工感染实验发现,其对健康梭子蟹具有致病性,出现与自然发病蟹相同的症状,并在人工感染病蟹中分离出同样性状的菌株,证实其为该病病原菌。