菠萝EST资源的SSR信息分析与开发

表达序列标签-简单重复序列(EST-SSRs)存在于表达序列标签中,是一种最常用的新型微卫星标记。它可以被嵌入到功能基因序列中,有效并高效地提供更多的相关信息。通过对已公开的5 659条菠萝Ananas comosus的表达序列标签(ESTs)进行电子筛选,获得了617条含有简单重复序列(SSR)的菠萝EST。平均7.39 kb EST序列中含有1个SSR,其中二核苷酸,三核苷酸和六核苷酸是SSR的主要重复类型,分别占SSR总数的42.61%,29.25%和20.13%。所有重复类型中重复次数最少的是四核苷酸序列(3.46%)。AG/TC是二核苷酸中的优势单元。根据搜索出的EST序列,共设计出30对物,其中27对引物扩增产物具有多态性。本次实验中开发的EST-SSR标记是迄今为止有关于菠萝的第1次大规模SSR标记开发。研究结果为利用EST-SSR分子标记进行菠萝连锁图谱构建,数量基因定位,种质资源遗传多样性,亲缘关系研究和指纹图谱构建奠定了基础。     

尖镰孢EST-SSR信息分析及分子标记建立

【目的】探讨尖镰孢（Fusarium oxysporum）表达序列标签（expressed sequence tag,EST）序列中简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点的分布特点,开发尖镰孢EST-SSR引物,为镰孢菌遗传多样性分析提供技术支持。【方法】从NCBI公共数据库下载尖镰孢EST 9 304条,利用SSRIT软件查找SSR位点,Primer Premier 5.0软件设计EST-SSR引物,用非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳分离SSR-PCR扩增产物,并选用能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的引物,对23株尖镰孢菌株进行SSR遗传多样性分析。【结果】在尖镰孢EST序列中,共搜索到92个SSR位点,分布于90条EST序列中,出现频率为1.0%。其中二核苷酸重复类型是最主要的SSR类型,占总SSR的比例为59.78%。其次为三核苷酸与五核苷酸重复类型,占总SSR的比例分别为17.39%、11.96%。出现频率最高的基序是（AC/GT）（0.51%）。设计合成的30对引物中有20对（66.7%）能够有效扩增,其中14对引物（46.7%）能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的产物。尖镰孢的遗传多样性分析结果表明,利用筛选出的14对引物扩增出62条条带,其中多态性条带59条,多态性位点比例为95.2%,平均每对引物可扩增4.2条。供试菌株间的遗传相似系数为0.487-0.933,平均为0.686。供试菌株间存在明显的遗传分化。聚类分析结果表明,当遗传相似系数为0.781时,除14号菌株外,所有菌株均根据寄主来源划分为不同的SSR类群。【结论】基于尖镰孢EST序列开发SSR标记是一种简便有效的方法,研究开发的14对引物可用于尖镰孢的遗传多样性分析。     

荔枝EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

 【目的】明确荔枝EST序列中SSR的总体特点,开发荔枝EST-SSR引物,为利用EST-SSR分子标记进行荔枝种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。【方法】应用SSRIT软件,按照设定标准从自行构建的一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库中的1 331条Unigene（惟一序列）中搜索SSR位点。利用软件Primer primer5.0设计EST-SSR引物。选用16份表型差异较大的荔枝种质资源检测引物的有效性及多态性,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行片段分离。【结果】荔枝的1 331条EST序列中共搜索出220个SSR位点,分布于189条EST中,出现频率是16.53%。这些EST-SSR的平均长度为18.43 bp,平均分布频率1/4.42 kb。在1—6 bp的重复基元中,二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位,共占总SSR的69.09%,二者出现的频率分别为37.27%和31.82%。共观察到72种重复基元,出现频率最高的是GA/TC（16.82%）;其次是AG/CT、A/T、AT/TA及GAA/TTC,频率分别为14.55%、11.82%、5.00%和3.64%。不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。设计、合成150对EST-SSR引物,122对（81.33%）引物在荔枝中获得有效扩增,100对引物具有多态性。【结论】荔枝EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR 标记开发效率较高。本研究为利用EST-SSR标记开展荔枝遗传研究提供了100 对EST-SSR引物,并为进一步开发荔枝EST-SSR标记提供了含SSR位点的候选序列。     

草莓EST-SSR标记开发及在品种遗传多样性分析中的应用

 【目的】探讨草莓EST序列中SSR位点的分布规律,开发草莓EST-SSR引物,并分析其在草莓品种遗传多样性研究中的应用。【方法】从NCBI公共数据库下载草莓表达序列标签（expressed sequence tag,EST）55 750条,利用MISA软件查找SSR位点,并利用Primer3.0 Plus软件设计60对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物进行克隆和测序,以验证其真实性。【结果】55 750条草莓EST序列含有SSR位点的序列1 334条,SSR位点1 490个。其中,二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占36.17%、26.51%和19.87%。60对引物中有42对引物能在20个草莓品种中扩增出理想的PCR产物,其中36对引物扩增条带具有多态性。利用11对验证的EST-SSR引物分析了20个草莓品种的亲缘关系。【结论】草莓EST-SSR标记的开发对于草莓品种鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

越橘EST-SSR分子标记的开发及其遗传多样性分析

【目的】探讨越橘EST序列中SSR位点的分布规律,开发越橘EST-SSR引物,并分析其在越橘品种遗传多样性研究中的作用。【方法】以91份越橘种质为材料,利用越橘果实转录组(RNA-Seq)的测序结果,通过SSRIT在线搜索,利用Primer Premier 5.0软件设计30对引物,并筛选扩增效果理想的引物,用筛选出的引物分析91份种质的多态性,构建91份种质的系统发育树。【结果】34 464条越橘unigene序列中含有SSR位点的序列有829条,SSR位点有913个,其中二核苷酸、三核苷酸重复是主要的SSR类型,分别占全部SSR位点的13.69%和81.27%。不同核苷酸数目重复基元的重复次数差异很大;越橘EST-SSR位点集中在11~15bp;三核苷酸和六核苷酸重基元复种类最多,在所有重复基元中GAA/TTC发生频率最高。设计的30对引物中有17对引物在供试越橘种质中扩增出理想的PCR产物,17对引物均有多态性。聚类分析结果显示,在遗传相似系数为0.69时,可以将供试越橘种质分成4组。【结论】EST-SSR标记可以用于越橘品种的鉴定与遗传多样性分析。     

辣椒EST-SSR信息分析及标记开发

利用SSRIT软件从NCBI数据库中19 173条辣椒EST序列中筛选到612个SSR,检出率为3.19%。共观察到51种重复基元,其中三核苷酸基序是主导类型,占总SSR的60.46%;AG/GA/CT/TC,AAG/AGA/GAA/CTT/TTC/TCT,TAAT,ATATA和CTGCTC分别是二、三、四、五和六核苷酸基序的优势重复基序,在所有SSR中的出现频率各自为13.40%、16.18%、1.80%、3.27%及2.12%。辣椒EST-SSR以5~10次重复为主,基序长度集中在15~20 bp范围内。利用含SSR的576条EST序列共设计357对引物,在合适的PCR条件下337(94.40%)对引物显示出清晰条带,75对(21.01%)引物表现多态性,表明EST-SSR标记在辣椒遗传分析与应用中是有价值且可行的。     

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST-SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Juglans regia Linn.）ESTs序列进行EST-SSR特征分析,利用利用Primer3.0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3.97%,平均分布距离为21.12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31.40%和35.27%;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST-SSR引物,将为胡桃科EST-SSR分子标记的开发奠定基础。     

茶树EST SSRs特点及应用

利用NCBI公共数据库下载获得的3 306条茶树EST,去除其中低质量和冗余的序列,得到全长为635.46 kb的1 335条无冗余EST,在这些序列中共发现216个SSR,分布于185个EST中,出现的频率为16.18%,平均每2.94 kb的表达序列中有1个SSR。茶树的EST-SSR类型丰富,其中二核苷酸重复出现的频率最高,占主导地位。利用Primer 5.0软件从185条含有SSR的EST中设计引物100对,从中随机选取60对引物检测EST-SSR在云南茶树资源中的多态性。结果表明,有30对引物在供试的63份茶树资源中得到有效扩增,并具有多态性;共检测到等位基因数71个,每对引物检测出的等位基因数2~8个,平均4.9个;多态信息量(PIC)变幅为0~0.731,平均为0.499;观察杂合度变幅为0~0.970,平均0.392。EST-SSR标记分析表明云南茶树资源具有较高的遗传多样性。     

麻风树EST-SSR的筛选和分析

[目的]开发麻风树EST-SSR标记,为遗传多样性分析、种质资源鉴定等研究提供理论依据。[方法]以麻风树EST序列为材料,运用CAP3软件对EST序列进行组装后,再运用SSRIT软件进行EST-SSR标记的预测。[结果]麻风树13193条EST序列经组装后获得6281个UniGene,其中1367个Contig,4914个Singleton。利用SSRIT在线软件对UniGene分析得到206条EST-SSR。拼接后的Unigene含有SSR位点的频率为3.28%,麻风树EST-SSR的发生频率为1/29kb。这些EST重复基元中,三核苷酸重复和二核苷酸重复最多,分别占24.76%和21.84%;五、六核苷酸重复次之,分别占16.50%、20.39%;单、四核苷酸的重复基序最少,分别占9.71%和6.80%。在所有的核苷酸重复基序中,二核苷酸重复序列AG所占比例最高,约占12.62%;三核苷酸重复序列中,所占比例最高的是AAT和AAG,各占6.80%、6.31%。[结论]上述结果对于开展麻风树分子辅助育种研究具有一定的指导意义。     

甘蓝EST资源的SSR信息分析

为了开发甘蓝EST-SSR功能性标记,从NCBI公共数据库检索到63201条甘蓝ESTs,通过前处理和聚类去冗余后得到全长为14828.60 kb的无冗余ESTs 23306条.在这些序列中搜索出3085个SSRs,分布于2616条ESTs中,出现频率是13.24%,与甘蓝开花过程中相关的EST-SSRs出现的频率为6.97%.这些EST-SSRs的平均长度为23.11 bp,平均分布频率是1/4.81 kb.在1～6核苷酸重复的基元中,二核苷酸重复和三核苷酸重复是主要类型,二者出现的频率基本相近,占总SSR的79.09%.AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复类型,分别占二、三核苷酸重复的79%和34%,对这些含SSR的ESTs进行BLASTx同源性比较分析,发现2616条EST-SSRs中1981条在数据库中可以找到同源物,占EST-SSRs总数的75.73%,功能已知的蛋白质中拟南芥来源的EST-SSRs所占比例最大,为66.02%,同时针对与甘蓝开花相关的EST-SSRs进行功能分析.找到同源物的1981条EST通过GOA进行功能分类,有987条可划分为生物过程、分子功能和细胞成分3大功能类群,其中与生物代谢相关的EST-SSRs数量最多,为263条,994条未被功能注释.