猪Ⅱ型圆环病毒江苏株全基因进化及ORF3蛋白的生物信息学分析

对NCBI已经登记的国内分离的PCV2江苏株(GQ358994.1)进行序列比对及进化分析,并对其ORF3编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学方法分析,对其组分、理化性质、跨膜结构域、二级结构、糖基化位点、磷酸化位点和B细胞抗原表位进行预测和推断。结果表明,PCV2江苏株与国内分离株序列同源性极高(>99%),ORF3蛋白无跨膜区域,二级结构中自由卷曲含量最高,为54.81%,不含有糖基化位点,但有8个磷酸化位点。综合分析得出,ORF3蛋白具有大量的抗原决定簇。通过对ORF3蛋白进行生物信息学方法分析,为PRRSV疫苗设计提供理论基础。     

大豆质膜内在水孔蛋白的生物学功能预测

[目的]利用生物信息学方法对大豆质膜内在水孔蛋白（GrnPIP）的亚细胞定位、跨膜区、信号肽和磷酸化住点进行预测,为基因的功能研究提供参考。[方法]从干旱胁迫后磊抗旱大豆品种21的叶片中克隆出GmPIP基因．利用PSLpced、Protcomp Version8．0、WoLF PSORT、CELLO v2．5等亚细胞预测工具进行亚细胞定位预测;利用TMHMM Serverv．2．0进行蛋白跨膜区分析;利用NetPhos 2．0 Server进行磷酸化位点分析;利用SignaIP3．0 Server程序进行信号肽分析。[结果]综合4种工具的预测结果表明,GmPIP蛋白包含6个跨膜区,亚细胞定位预测表明该蛋白位于细胞质膜上,发现该蛋白的第254个氧基酸是一个潜在的糖基化位点和13个磷酸化位点,该蛋白没有明显的信号肽结构。[结论]利用不同方法进行的生物信息学分析结果可相互验证,生物信息学可以对未知蛋白进行初步的功能预测．有助于确定后续试验的方向．     

毛白杨(BJHR01)磷酸肌醇特异性磷脂酶C(PLC2)基因生物信息学分析

[目的]用生物信息学手段分析、预测毛白杨PLC2基因/蛋白质的结构与特征,为该基因的克隆及功能研究提供理论参考。[方法]以PLC2基因及对应蛋白质为研究对象,利用各种网上数据库及生物信息学分析软件对其进行相关分析、预测。[结果]PLC2基因的GenBank登录号为JX424764.1,ORF长957bp,编码318个氨基酸,对应蛋白质PLC2的分子量35 999.1D,理论等电点7.07;PLC2与毛果杨（XP₀02313726.1）的同源性较高;PLC2属于PI-PLCc_GDPD_SF超家族,无O-糖基化位点,无二硫键,无跨膜区和信号肽,有16个磷酸化位点。[结论]对PLC2基因/蛋白的各级结构及功能进行预测,为下一步试验奠定基础。     

猪博卡病毒NP1基因的克隆及其生物信息学分析

根据Gen Bank发表的猪博卡病毒主要抗原基因NP1基因设计1对引物,采用降落PCR方法进行扩增,克隆后测序,并对该基因进行生物信息学分析。结果表明:成功克隆到猪博卡病毒NP1基因;NP1蛋白的二级结构中自由卷曲含量最高(51.77%),无跨膜蛋白,含有1个糖基化位点、30个磷酸化位点,有6个线性B细胞优势抗原表位,分别位于NP1蛋白的7—14位、27—50位、59—73位、85—94位、102—108位、151—155位。     

大麻CBDA1基因的生物信息学分析

[目的]研究大麻二酚酸合成酶基因(CBDA1)编码的蛋白质序列所包含的生物学信息。[方法]利用生物信息学在线工具及软件分析大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的理化性质、亲/疏水性、跨膜结构、信号肽、motif结构域及空间结构等。[结果]CBDAS由544个氨基酸组成,分子量为62 168.42,理论等电点为8.81,是一种稳定的亲水性分泌蛋白,N末端包含1个由28个氨基酸残基组成的信号肽,该蛋白的亚细胞定位在胞外。CBDAS属于氧化还原酶家族,FDA是该酶活性的必需辅因子,CBDAS蛋白中只含有1个低复杂度区域,含有23个磷酸化位点和6个N-糖基化位点,其二级结构主要由α-螺旋、β-转角和无规卷曲组成,三级结构与四氢大麻酚酸合成酶(THCAS)同源性最高。[结论]该研究结果可为今后深入研究CBDAS蛋白的结构特征和功能提供理论参考。     

紫花苜蓿乙酰CoA硫解酶的生物信息学分析与同源建模

[目的]对紫花苜蓿中的乙酰CoA硫解酶进行生物信息学分析与同源建模。[方法]应用生物信息学软件预测紫花苜蓿乙酰CoA硫解酶的理化性质、亲/疏水性、卷曲螺旋结构、糖基化位点、活性位点、亚细胞定位、二级结构、结构域及三维高级结构。[结果]该蛋白质是一个极疏水性蛋白,含403个氨基酸,理论等电点为6.95;包含1个明显卷曲螺旋结构、5个糖基化位点、1个硫解酶结构域;二级结构中α-helix(Hh)占39.95%、Extended strand(Ee)占16.38%、Random coil(Cc)占43.67%;Ramachandram结构检测表明预测蛋白质残基的二面角有90%以上位于黄色区域,符合立体化学能量规则。[结论]为该蛋白功能的探索提供了一定的理论参考。     

蛋白激酶C的克隆和生物信息学分析（英文）

[目的]PKC在信号转导、气孔调节、细胞分化中具有重要作用。该研究目的是为了克隆蛋白激酶C并预测它的性质。[方法]从玉米B73中克隆得到zm PKC(玉米蛋白激酶C)的c DNA,并且通过生物信息学的方法预测了它的特性,包括保守结构域、理化性质、特殊磷酸化位点和N端糖基化位点等。[结果]证明zm PKC长1 269 bp,编码422个氨基酸,有一个外显子和俩个内含子及一个蛋白激酶域,2个N端糖基化位点和28个特殊磷酸化位点,等电点为4.98,分子量为132 074.70。[结论]zm PKC的克隆和生物信息学分析能利于进一步研究PKC的功能。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白的亚细胞定位与功能预测

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位,并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化,首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能,之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞,并接种PRRSV,通过间接免疫荧光方法检测NSP9蛋白的表达与定位情况。功能预测结果表明,NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。间接免疫荧光检测结果显示,PRRSV感染之初,NSP9蛋白定位在Marc-145细胞质中,围绕在细胞核附近,随PRRSV感染时间延长,其逐步往细胞核内转移,转移的面积也逐步增多。可见,PRRSV感染会引起NSP9蛋白向核内转移。     

石渠棘球绦虫Es95基因克隆及序列分析

[目的]首次克隆获得石渠棘球绦虫Es95基因,并进行序列分析,为研究抗包虫病候选疫苗提供理论指导。[方法]从高原鼠兔肺脏包囊上获得石渠棘球绦虫原头蚴,提取全基因组,并根据NCBI上6种棘球属绦虫95基因序列设计引物,以基因组DNA为模板扩增到Es95基因,并克隆到T载体上,测序后进行序列分析。[结果]以石渠棘球绦虫全基因组DNA为模板扩增出Es95基因长为1 330 bp,序列分析含有3个外显子和2个内含子,有1个糖基化位点,N端有一信号肽序列(16个氨基酸),C端有跨膜区(23个氨基酸),亲水性低,B细胞抗原表位预测有ES95潜在抗原表位6个。[结论]ES95是一个分泌性糖蛋白,在包虫病的预防上具有重要意义。     

斯氏副柔线虫SHR基因表达载体的构建及生物信息学分析

为探讨斯氏副柔线虫免疫相关SHR基因作为疫苗候选抗原及早期诊断抗原的可能性,提取斯氏副柔线虫的总RNA,用RT-PCR技术扩增SHR基因,并将PCR产物克隆到pMD19-T载体,构建原核表达载体pET-30a(+)-SHR,利用在线软件对该基因编码蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明:克隆获得SHR基因全长1 083 bp,编码360个氨基酸,理论等电点为6.09,无信号肽和跨膜区;磷酸化预测含有29个磷酸化位点;结构分析发现,α-螺旋构成二级结构的主要成分,亲水性氨基酸比例超过60%;抗原表位预测表明,SHR蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白。推测SHR有望用作斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。     

安徽省猪蓝耳病疫苗临床免疫效果调查

[目的]为科学、客观评价猪蓝耳病疫苗临床应用效果,对猪蓝耳病防控工作提供参考依据;[方法]选择安徽省40家规模养殖场,对目前市场上常用的4种蓝耳病疫苗分别为普通蓝耳灭活疫苗、高致病性蓝耳病灭活疫苗、国产弱毒疫苗与进口蓝耳病弱毒疫苗进行疫苗使用情况的调查;[结果]受蓝耳病污染的猪场使用弱毒疫苗免疫效果较好,普通灭活疫苗效果不明显,高致病性灭活疫苗针对猪蓝耳病阴性猪群免疫效果较好;[结论]弱毒疫苗效果较好,但接种后可在体内增毒。猪蓝耳病的预防关键要加强饲养管理,采取综合防控的措施。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332bp（经典株）和241bp（变异株）,根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难、病毒血症为典型症状的一种传染性疾病,给世界养猪业带来巨大的经济损失。深入研究PRRSV的相关致病机制可为该病防控奠定理论依据。在对PRRSV的研究中,非结构蛋白2(non-structural protein 2, Nsp2)一直是研究的热点,文章综述了Nsp2与遗传变异、病毒致病性、病毒复制、免疫调控和重组疫苗与分子标签等相关的研究进展。Nsp2基因序列在对疫苗毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。     

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的生物信息学分析

[目的]对ArgE蛋白的结构和功能进行初步预测。[方法]以在GenBank上查找到的若干微生物N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶基因序列为分析对象,以ArgE(P23908)为研究对象,利用生物信息学在线软件ORF finder、ProtParam和Protscale等对ArgE编码的蛋白N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的二级结构和特殊结构、序列同源性、结构域及功能位点进行了初步预测。[结果]ArgE蛋白是一种酸性可溶性蛋白,理论等电点为5.54,分子量为42 347.3,无信号肽,为非分泌蛋白,有多个磷酸化位点。蛋白中存在α螺旋、β-折叠和无规则卷曲结构,有2个可形成跨膜结构的片段,不存在卷曲螺旋,也无线粒体定位信号。ArgE蛋白与CBPG、DAPE、ACY1、YSCS几种蛋白具有较高的相似性。[结论]该研究可为ArgE蛋白的结构和功能的实验研究提供理论依据。     

中国部分地区2005－2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因和Nsp2基因遗传变异分析

 【目的】为分析2005－2007年间中国部分省区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律,查明中国目前PRRSV流行毒株现状。【方法】应用病毒分离方法从中国4个省份在2005－2007年间采集的81份疑似蓝耳病病料中分离到36株猪繁殖与呼吸综合征病毒,应用RT-PCR方法对36株PRRSV现地分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行扩增和序列分析。【结果】36株现地分离株均属于美洲型 PRRSV,ORF5基因全长均为603 bp,未发现有基因缺失或插入,编码约200个氨基酸,分离株推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;36个分离株中有15株PRRSV Nsp2基因全长为2 940 bp,21株PRRSV Nsp2基因全长为2 850 bp;发生Nsp2缺失的PRRSV在Nsp2基因第481位、532～560位发生了不连续缺失,共缺失30个氨基酸。与GeneBank中收录的14个PRRSV ORF5、Nsp2基因进行核苷酸及氨基酸序列比较和分析,系统进化关系显示,除B02-2005株可能与疫苗株有关外,多数现地分离株与Ch-1a株遗传距离较近,不同年份分离到的毒株与早期PRRSV分离株的同源性逐年降低。【结论】根据氨基酸变异情况对PRRSV现地分离株进行亚群聚类分析,发现36株现地分离株分别归属于以VR-2332为代表的4亚群,以BJ-4为代表的1亚群和以Ch-1a为代表的２亚群。进化关系表明PRRSV ORF5、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列均发生了较大变异,不同地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。     

表达PRRSV 强弱毒Nsp2的Marc 145细胞系的建立及Nsp2蛋白对PRRSV复制的影响

为探讨Nsp2蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响,采用体外克隆法构建表达高致病性PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2基因的真核表达质粒pEGFP-TJ Nsp2和pEGFP-TJMNsp2,含有增强式绿色荧光蛋白表达盒,瞬时转染重组质粒到Marc-145细胞系单层,利用G418抗性筛选建立细胞系,通过PCR和RT-PCR鉴定。PRRSV感染筛选的细胞系,检测病毒TCID50。结果建立稳定表达TJ株和TJM株Nsp2基因的猴肾细胞系Marc-145-TJ Nsp2和Marc-145-TJM Nsp2;在表达PRRSV TJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞上感染PRRSV病毒,在复制早期病毒时增殖速度快,即Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用,并且强毒的Nsp2此作用更明显。     

佛手瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

[目的]克隆佛手瓜鲨烯合酶(SQS)基因,并基于克隆的SQS序列分析该酶的分子结构,为佛手瓜生物活性成分的利用提供理论依据。[方法]根据SQS基因5'末端保守序列和3'race方法扩增的佛手瓜SQS基因3'末端序列设计佛手瓜SQS基因克隆引物。扩增的佛手瓜SQS基因片段插入p GEM-T Easy Vector后经DNA测序。应用生物信息学方法分析克隆序列的开放阅读框架(ORF)、酶蛋白的疏水性/亲水性和蛋白质磷酸化位点,预测酶蛋白的二级结构、结构域、三级结构和跨膜区。以布朗葡萄藻为outgroup,应用MEGA 5.0进行UPGMA算法构建系统树,并进行1 000次的Bootstrap测试。[结果]佛手瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为6.983。构象预测提示该酶二级结构以α螺旋为主,是一种只有三级结构的单体酶,其活性中心是主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构,酶蛋白肽链中具有1个跨膜区。结构域分析表明SQS属于异戊二烯合酶家族。磷酸化位点分析显示该酶共有17个磷酸化位点,其中,S48位于与酶活性中心相关模体中,而S196为陆生植物SQS基因的正选择位点。以佛手瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树得到的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。[结论]佛手瓜SQS是由417氨基酸残基构成的单体酶,具有1个跨膜区和17个磷酸化位点,其中,S48和S196可能是佛手瓜SQS酶活性调节的关键性磷酸化位点。     

PRRSV非结构蛋白2-半胱氨酸结构域的原核表达及抗原表位预测

为了获得PRRSV非结构蛋白2-半胱氨酸结构域的高纯度原核表达蛋白以及了解该蛋白的抗原表位,试验以从PRRSV-VR2332毒株上提取的病毒全基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增非结构蛋白2-半胱氨酸结构域(Nsp2pro)基因,连接构建原核表达载体SUMO-Nsp2pro,转入宿主菌Rosetta2,经IPTG诱导,获得高浓度的可溶蛋白Nsp2pro,经亲和层析His-Bind后得到高纯度的目的蛋白。同时,运用生物信息学方法对Nsp2pro二级结构及抗原表位进行预测。结果显示,Nsp2pro的α螺旋及β折叠区域较多,转角区域较少,结构较为复杂,位于蛋白分子表面且亲水的区段很可能是B细胞表位的优势区段。获得较高纯度的蛋白,将为后续进一步研究Nsp2pro基因编码的蛋白在病毒复制过程中的作用奠定基础。