甜樱桃‘拉宾斯’自交亲和性与SFB4′基因的关系研究

甜樱桃品种‘拉宾斯’与‘雷尼’均为S1S4基因型。调查其自花结实率,‘拉宾斯’为31.3%,表现自交亲和;‘雷尼’为0,表现为自交不亲和。将‘拉宾斯’与‘雷尼’相互授粉,‘拉宾斯’为父本时表现亲和,反之不亲和,推断‘拉宾斯’的自交亲和性由花粉侧突变导致;调查花粉萌发率,‘拉宾斯’为58.08%,‘雷尼’为57.82%。鉴定‘拉宾斯’自交后代及其与‘雷尼’杂交后代的S-RNase的基因型,发现所有后代中均出现S4基因型,部分后代中出现S1基因型,证明‘拉宾斯’花粉育性是正常的,其亲和性可能是由S4基因座上花粉侧的基因突变导致。测序发现‘拉宾斯’花粉SFB4′在911 bp处有4个碱基缺失。分析‘拉宾斯’花粉SFB4′与花柱S4-RNase的连锁性,发现两者连锁率为100%。以‘拉宾斯’为父本的带有SFB4′的杂交后代的自花结实率为23.3%~61.4%,表现自交亲和,说明来源于‘拉宾斯’的SFB4′基因与自交亲和性有关。RT-PCR及测序显示‘雷尼’SFB4与‘拉宾斯’SFB4′均能正常转录,但4个碱基缺失导致其C端翻译提前终止,原核表达SFB4和SFB4′蛋白发现SFB4略大于SFB4′,推测是由于SFB4′的翻译提前终止导致的。以上结果表明:‘拉宾斯’的自交亲和性可能是由花粉侧SFB4′C端的氨基酸缺失导致,该缺失可能使其丧失了与S-RNase的识别能力。     

扁桃SFB基因的克隆及其生物信息学分析

以新疆扁桃栽培品种麻壳的花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个全长为1131bp的SFB基因(Genbank登录号为:EU909685),命名为AcSFB10。该基因编码376个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序。经生物信息学分析,推测AcSFB10蛋白的分子式为C2000H3033N517O558S23,相对分子质量为43985.5,等电点为6.02,二级结构以α螺旋为主;理论推导半衰期大约为30h,不稳定参数为53.21,属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起裂合酶的作用,特异性的识别底物,正好吻合了F-box蛋白的作用。     

新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因的检测

 为系统鉴定新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因型,以新疆25个主栽杏品种为试材,利用蔷薇科保守序列设计引物对叶片基因组DNA进行SFB基因特异PCR扩增,筛选出有效的扩增引物;对成功扩增的杏品种的特异条带克隆测序,在GenBank上进行BLASTN比对,确定各品种的SFB基因型。结果显示：引物组合Ⅱ-1、Ⅳ-2,1-Ⅰ、1-Ⅱ对新疆杏品种的扩增效果最好,成功地在18个品种上扩增出了5种大小不同的条带,14种不同的基因型,其中两     

‘小白杏’自交不亲和SFB基因RNAi表达载体的构建

【目的】应用RNA干扰(RNAi)技术在分子水平调控杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】基于南疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca‘Xiaobaixing’)花粉决定子SFB(S-haplotype-specific Fbox protein)基因3’端c DNA全长序列,选取SFB基因变异区上游距起始密码子61 bp处、大小为29 bp的片段作为干扰序列,棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR(Fusion PCR)构建SFB基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihp RNA),再酶切连接到植物表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII上,构建SFB基因RNAi表达载体;用冻融转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】测序结果表明臂长29 bp、茎环242 bp的SFB基因ihp RNA结构融合成功,双酶切检验和PCR验证结果表明,该结构正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,说明SFB基因的RNAi表达载体p CAMBIA-RNAi-SFB构建成功;PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究结果表明,应用融合PCR结合酶切连接的方法构建SFB基因的RNAi表达载体是可行的,为RNAi技术在果树自交不亲和性状改良上的应用创造了条件。     

新疆杏品种SFB基因的克隆及实时定量表达

以新疆杏27个品种花粉为材料,进行转录水平SFB基因的克隆与测序;选取冬杏、苏陆克、库尔勒托拥3个杏品种,对其进行花粉离体培养,分析SFB基因在不同时期的表达特性。结果表明,在27个品种中扩增出4种大小不同的条带,引物组合1在26个品种中扩增出条带,其中品种贝新纳尔,赛买提的片段大小为447 bp;大优佳的片段大小为446 bp,其余品种的大小为434 bp。引物组合2在品种托乎提中扩增出大小为660 bp大小的条带。序列比对显示27个品种的SFB基因为20种基因序列,与其他物种SFB基因序列比对显示20种基因序列均为新SFB基因序列,在GenBank上的登录号为:HQ148064-HQ148083;SFB基因在3个杏品种花粉离体培养不同培养时期均有表达,其表达丰度的变化趋势一致,呈先增后减的趋势,均在培养24 h时表达丰度最高,但是每个品种的表达峰值不同。     

中国杏自交不亲和花粉特异SFB基因的鉴定与序列分析

利用花粉SFB基因的同源扩增结合内切酶酶切的方法,在9个中国杏品种中首次克隆了6个花粉SFB基因,对应花柱S-RNase基因序号将其分别命名为Par-SFB8、Par-SFB9、Par-SFB11、Par-SFB17、Par-SFB23和Par-SFB26,在GenBank上的登录号分别为EU652883、EU935588、EU652884、EU652885、EU652886和EU652887。序列分析表明杏的花粉SFB基因具有蔷薇科李属植物SFB基因的典型结构特征;其内含子位于5′端非翻译区,长度90 ~ 108 bp,核苷酸序列的同源性为63.9% ~ 93.3%。氨基酸序列的同源性比较表明,杏花粉SFB基因的种内同源性为73.7% ~ 85.3%;与李属其他植物花粉SFB基因的种间同源性为75.2% ~ 97.7%。利用特异PCR扩增进一步确定了杏的S9、S11、S17和S26单元型花柱S-RNase与花粉SFB基因间距离,表明花柱S-RNase与花粉SFB基因紧密连锁;同时组织特异性表达分析确定SFB基因在花粉组织中特异表达。以上结果说明获得的SFB基因为杏的花粉候选S基因。     

甜樱桃S基因型PCR鉴定技术研究

绝大部分甜樱桃品种自交不亲和,因此自交不亲和基因型的鉴定对于生产具有重要的意义。以甜樱桃主栽品种为试材,建立基于PCR技术的甜樱桃品种S基因型鉴定技术。试验根据已发表的樱桃S基因序列设计了2对引物组合BFP73/74,BFP93/94,结合S1、S5基因的特异扩增引物,利用扩增片段长度的不同,就可以对樱桃品种的S基因型进行鉴定。通过对已知S基因型品种基因组的扩增,最终建立了基于PCR技术的甜樱桃品种S基因型鉴定技术。     

李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析

【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类,为病毒的分子检测提供基础。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒(PNRSV)。以阳性样品的总RNA为模板进行PNRSV外壳蛋白基因(CP)RT-PCR扩增,对预期430 bp大小的4个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。【结果】结果表明,PNRSV新疆巴旦木分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高的同源性,分别为80.0%～97.2%和80.1%～94.1%,其中与阿根廷分离物AY217的同源性最高;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(ApMV)同源性较低,仅为52.9%～55.4%和45.6%～48.6%。新疆PNRSV各分离物之间CP基因高度同源。序列比对与系统发生树的分析显示,PNRSV新疆巴旦木分离物的株系属于GroupⅠ组。【结论】确定了PNRSV为侵染新疆巴旦木果树的病原病毒。这是PNRSV在新疆发现的首次报道。     

金属硫蛋白基因转化黄瓜的研究

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体,通过叶盘转化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的遗传转化体系.比较了不同苗龄,不同侵染时间对黄瓜离体再生的影响,并做了潮霉素敏感性测试.结果表明:苗龄3～4 d的子叶,侵染时间为15min,潮霉素浓度为25 mg/L最适分化出抗性小苗.最终获得3株抗性植株,经过PCR和PT-PCR检测,初步确定均为阳性转化植株.     

扁桃AcSFB基因的克隆与原核表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术, 从新疆栽培扁桃‘鹰嘴’花药中获得了一个全长的SFB ( S-hap-lotype-specific F-box gene) 基因(GenBank登录号为FJ362525) , 命名为AcSFBd。该基因全长1 125 bp, 编码374个氨基酸, 在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F2box基序, 含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(V1和V2) 。生物信息学的方法成功预测了AcSFBd蛋白分子质量为43 kD, 为亲水性、非分泌型蛋白, 在基质内起连接酶(EC6. - . - . -) 的作用。成功构建了原核表达载体, 并转化大肠杆菌BL21 (DE3) , SDS2PAGE检测结果显示表达了一个约60 kD的蛋白。     

与苹果柱型基因(Co)相关的AFLP标记片段的克隆

Co基因是与苹果树体生长习性有关的一个主基因，是培育树体紧凑型苹果品种的一个十分重要的基因资源，所以，Co基因分子标记的研究对苹果育种具有重要价值。用PCR的方法将以短枝富士×舞姿的F1分离群体为试材筛选到的一个与Co基因连锁较为紧密的AFLP标记成功地进行了再扩增，同时也实现了此标记片段的克隆和转化。这一研究结果对该AFLP标记向SCAR标记的转换具有重要意义。     

甜樱桃品种中新多态性SSR的鉴定、指纹图谱构建及聚类分析

【目的】应对迅速增加的甜樱桃品种及其分子鉴定需求,储备一批新多态性SSR,并获得其在甜樱桃品种中的基因型数据。【方法】从甜樱桃基因组测序开发的SSR库中,根据重复单元和重复次数在8条染色体上一共选择了96个SSR。用ABI3730,鉴定出其中9个SSR在4个代表甜樱桃品种中具有多态性。另外从305个李属SSR中又鉴定出9个多态性SSR。用S基因和多态性SSR排除了52个品种122个单株中S基因型不正确和混杂的品种或单株,然后用多态性信息比价高的11个SSR(其中包括8个新SSR)和S基因标记,构建了48个甜樱桃品种的指纹图谱库,并获得了可以区分48个品种的最少标记组合。【结果】聚类分析表明,48个甜樱桃品种组成了短低温组、中国组、北美组和东欧组。聚类分析结果可以和品种间亲缘关系及地域来源互相验证。【结论】鉴定了3个从未报道的甜樱桃品种的S基因型,验证了一种可以有效获得多态性SSR的途径,提供了9个新的多态性SSR及其等位基因大小,用12个分子标记构建了48个甜樱桃品种指纹图谱。本文提供的新SSR及其构建的甜樱桃品种指纹图谱真实可靠。     

白细胞介素-4基因转化胡萝卜的研究

以胡萝卜‘长城红明’与‘开拓者’胚轴为受体材料,研究了菌种、预处理、农杆菌菌液浓度、侵染时间和共培养时间对胡萝卜胚轴转化率的影响.结果表明:C58C1菌株对胡萝卜胚轴伤害较小;‘长城红玥’以7日龄无菌苗于4℃预处理3d,经3.2×107个/mL农杆菌菌液侵染6min,共培养3d,转化率可达60％;‘开拓者’以7日龄无菌苗于4℃预处理3d,经4.8×107个/mL农杆菌菌液侵染10 min,共培养4d,或7日龄无菌苗于4℃预处理10 d,经3.2×107个/mL农杆菌菌液侵染10 min,共培养2d转化率可达100％;但2个品种均以7日龄无菌苗于4℃预处理3d,经1.6×107个/mL农杆菌菌液侵染2min,共培养2d,可得最多转化苗.     

苹果柱型基因Co的一个AFLP 标记的SCAR转换

 将苹果柱型基因的一个AFLP 标记成功地转换成了简单实用的SCAR 标记。首先对AFLP 标记片段进行序列测定, 然后根据序列特点设计了两对特异引物CoA1/ CoA2 和CoA1/ CoA3 , 每条引物长20 bp。PCR 结果表明CoA1/ CoA2 可以扩增出216 bp 和148 bp 两条带, 其中216 bp 的为柱型性状的特征带; CoA1/CoA3 可以扩增出273 bp 和205 bp 的两条带, 其中273 bp 的为柱型性状的特征带。两对引物在杂交后代中扩增出的特征带与柱型性状的分离重组率都很低(CoA1/ CoA2 为6. 3 % ±2. 5 %; CoA1/ CoA3 为7. 3 % ±2. 6 %) , 所以它们都可以作为该SCAR 标记的特异引物所用。     

八月酥等14个梨品种自交不亲和基因(S基因)型的鉴定

多数梨品种自花授粉不结实,生产上要合理配置授粉品种才能获得应有的产量。鉴定梨品种的S基因型,能为梨园合理配置授粉品种提供依据。以我国育成的梨品种为试材,利用特异引物PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及DNA序列分析,鉴定出了14个梨品种的自交不亲和基因型(S基因型),并通过统计部分品种的田间人工授粉的坐果率以及应用荧光显微镜观察异花授粉后花柱内的花粉管生长情况来验证鉴定出的梨品种S基因型的可靠性。这些品种的S基因型为:八月酥S3S16、绿云S3S29、谢花甜S29S34、香茌S1S21、脆绿S3S4、新雅S4S34、雅青S4S34、伊犁红句句S22S28、猪嘴酥S19S22、假直把子S5S19、青魁S1S3、德胜香S3S29、张掖长把S3S29、金坠梨S21S34。     

TYLCV外壳蛋白基因植物表达载体构建及转化番茄的研究

以"特大瑞光"番茄为受体植物,采用农杆菌介导法,将含有番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白(TYLCV-CP)基因的植物表达载体pCAMBIA3301转入番茄子叶外植体,对获得的13株草胺膦抗性番茄植株进行PCR和Southern Blot技术检测。结果表明:有10株呈阳性检测反应,说明TYLCV-CP基因已整合到番茄基因组中,阳性率为76.9%;番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。     

甜樱桃DELLA蛋白基因PaGAI的克隆与表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术从甜樱桃（Prunus avium L.）嫩叶中克隆了赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白基因cDNA全序列,将其命名为PaGAI。该基因cDNA全长2 310 bp,开放阅读框ORF为1 788 bp,推测其编码一个含有595个氨基酸残基的多肽链,蛋白质分子量约64 kD。生物信息学分析结果表明,PaGAI编码蛋白具有DELLA蛋白保守结构域,其N端存在两个非常保守的酸性结构域DELLA和VHYNP作为信号感知区域,C端有VHIID、RVER 和SAW结构域作为阻遏区域。PaGAI与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性,其中与苹果MdRGL2b蛋白同源性最高,达到84%。构建pGEX-4T-1/PaGAI原核表达体系,并转化E. coli BL21,经0.5 mmol · L-1 IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测获得了分子质量为91 kD的融合蛋白,半定量RT-PCR分析表明,PaGAI在花、果实、叶片、韧皮部中普遍表达,在花与韧皮部中的表达远远强于在果实与叶片中的表达。     

植物基因克隆技术的发展与展望

抑制性差减杂交技术和基因芯片技术是近年来发展起来的研究基因差异表达的2种非常有效的方法.SSH技术或基因芯片技术单独使用都存在不同程度的缺陷和不足,但若将2种技术结合起来使用,则能充分发挥各自的优势,并最大限度地弥补各自的不足.鉴于此,对SSH技术与基因芯片技术的原理与优缺点以及两者的结合在植物研究上的应用进行了综述.     

砂糖橘上碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对广东砂糖橘碎叶病毒的外壳蛋白(CTLV-CP)基因进行了克隆和测序分析。DNA序列分析表明,砂糖橘CTLV-CP基因的cDNA序列全长为786bp,编码262个氨基酸。BLAST分析结果显示,所得序列与苹果、梨茎沟病毒(ASGV)外壳蛋白基因及其它柑橘CTLV-CP基因的同源性在87%～91%,证明所克隆的片段为CTLV-CP基因。