PRRSV安徽分离株感染仔猪病理学的研究

本研究应用从安徽地区猪场分离的猪繁殖与呼吸障碍综合征HS08株和ZJ08株毒株人工感染仔猪,用猪繁殖与呼吸障碍综合征抗体检测试剂盒测定试验猪血清中PRRSV抗体,并应用组织病理学方法对感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）的仔猪病理组织进行研究,在生产实践中对PRRSV的防治意义非常重大。     

PRRSV缺失变异毒株HB-2(sh)/2002在人工感染仔猪组织中的分布与定位

用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HB-2(sh)/2002滴鼻感染30日龄健康仔猪,分别于3、7、14、28、42天宰杀,用免疫组化法对呼吸道,泌尿道,生殖道和消化道的主要器官以及脑和主要淋巴器官中的病毒抗原进行了定位分析。结果表明,在各个时间段,病毒抗原阳性率最高的器官为呼吸道、消化道沿途的淋巴结,组织中的阳性细胞多数为巨噬细胞和树突细胞,从个别猪的脑、心肌、肝和呼吸道上皮的细胞检测到阳性信号,同时发现该毒株主要在巨噬细胞和呼吸道腺上皮细胞复制。     

人工感染PRRSV JXA1株仔猪肾脏组织病理变化及病毒分布

为了解感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)仔猪肾脏组织的主要病变和病毒主要分布的细胞类型,试验取人工感染PRRSV JXA1株的仔猪肾脏组织制作石蜡切片,采用HE染色法观察其病理变化,采用免疫组织化学方法检测病毒GP5蛋白和N蛋白在肾脏组织内的分布.结果 表明,感染仔猪的肾脏组织呈现广泛性充血和出血,大量的炎症细胞...     

仔猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒定位研究

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduction and respiratory syndrome virus,PRRSV)天津分离株(PRRSV-SJ株)滴鼻感染10日龄～15日龄PRRSV阴性的健康仔猪,采用免疫组织化学法检测PRRSV在仔猪体内靶器官的动态分布,初步探讨PRRSV感染后在仔猪体内的病毒分布规律.结果表明,间接免疫组织化学法发现PRRSV-SJ株感染仔猪后1 d～28 d,均可在仔猪肺、淋巴结、扁桃体、气管、脾、肾等组织中检出PRRSV.感染后1 d～7 d,肺门淋巴结和扁桃体的病毒阳性细胞数量最多,阳性反应强.感染后14 d～28 d,脾脏的病毒阳性细胞数量多,阳性反应强.感染后1d,PRRSV就可在气管、肺门淋巴结和扁桃体检出.     

PRRSV在仔猪体内的分布规律及其对组织的病理性损伤

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在仔猪体内的分布规律及其对组织的病理性损伤,试验将3头60日龄的健康仔猪随机分为2组,A组2头,B组1头.A组滴鼻接种PRRSV LC毒株(TCID50为1×10-5.25/0.1 mL)3 mL/头,B组为对照组,观察临床症状.攻毒25 d后剖杀,采集淋巴结、脾脏、肺脏和肝脏各2份,其中一份进行中性福尔马林固定,制作石蜡切片,观察组织病理学变化;另一份在-70℃保存,利用RT-PcR检测PRRSV.病理学检查结果表明:肺脏出现明显的间质性肺炎,肺泡渗出物增多,可见局灶性出血;脾脏和淋巴结可见出血、增生;肝脏中央静脉及门管区静脉可见明显的淤血.利用RT-PCR方法在淋巴结、脾脏、肺脏和肝脏中都检测到了PRRSV.     

PRRSV在仔猪体内的分布规律及其对组织的病理性损伤

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在仔猪体内的分布规律及其对组织的病理性损伤,试验将3头60日龄的健康仔猪随机分为2组,A组2头,B组l头.A组滴鼻接种PRRSV LC毒株(TC:ID50为1×10-5.25/0.1 mL)3 mL/头,B组为对照组,观察临床症状.攻毒25 d后剖杀,采集淋巴结、脾脏、肺脏和肝脏各2份,其中一份进行中性福尔马林固定,制作石蜡切片,观察组织病理学变化;另一份在-70℃保存,利用RT-PCR检测PRRSV.病理学检查结果表明:肺脏出现明显的间质性肺炎,肺泡渗出物增多,可见局灶性出血;脾脏和淋巴结可见出血、增生;肝脏中央静脉及门管区静脉可见明显的淤血.利用RT-PCR方法在淋巴结、脾脏、肺脏和肝脏中都检测到了PRRSV.     

应用RT-PCR检测猪粪便中PRRSV

通过逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR），设计特异性引物检测猪粪便中猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因片段。结果发现，所检测的8份猪粪便样本中有6份扩增出了目的条带，判定为阳性。     

荧光定量RT-PCR法对高致病性PRRSV变异株感染猪体内分布规律的研究

根据GenBank发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株Nsp2基因序列设计1对特异引物,以重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR-Green Ⅰ嵌合荧光染料建立了1种荧光定量RT-PCR方法用于检测该病毒核酸载量,在101~106拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.999 8,扩增效率为E=0.950,对质粒标准品最低检测限为12.8拷贝/μL,重复性检测的变异系数低于2.0%。用高致病性PRRSV变异毒株人工感染25日龄非免疫仔猪,对不同时间采集的血清进行了病毒核酸定量检测,结果表明病毒血症于攻毒后48 h被检测出,于7~10 d达到高峰,其病毒核酸载量能达到106拷贝/μL。试验猪临床表现为体温升高至40.5℃以上,持续7~11 d;出现嗜睡、打喷嚏、眼结膜炎、偶见一过性的耳尖发绀、皮肤苍白或有小疱疹、被毛粗糙、消瘦、便秘、后躯无力等临床症状。感染猪发生高热期与毒血症消长规律有一定相关性。对人工感染猪体内病毒分布检测结果表明,以多种脏器均有病毒存在,如扁桃体、淋巴结、心脏、肾脏中含量较高,肝、脾脏和肺次之,脑组织中也检测到病毒存在。试验表明,该方法可用于PRRSV变异毒株核酸定量检测,为该病毒致病性、致病机理、疫苗免疫及诊断等方面的研究提供了技术手段。     

PRRSV感染致断奶仔猪肺脏和外周免疫器官的病理损伤

用PRRSV ATCC VR-2332株感染8头28日龄仔猪,同时设立2头健康对照猪.PRRSV单独感染猪分别于感染后7,17,25 d各剖杀2,3,3头,对照组于17,25 d各剖杀1头.剖杀后采集脾脏、肺脏和全身主要淋巴结(颌下淋巴结、肺门淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结)等免疫器官,用甲醛溶液固定,组织石蜡切片以观察显微病理变化.试验组猪的抗体和抗原检测结果均表明,感染后7 d血清PRRSV抗体和免疫器官组织PRRSV抗原部分呈阳性;剖检和石蜡切片结果均显示,试验猪于攻毒后,随着病程的发展,发生了不同程度的间质性肺炎及相应的显微病变,PRRSV单独感染能引起免疫器官以淋巴细胞及巨噬细胞变性坏死为特征的急性炎症变化,造成免疫损伤,进而引起免疫抑制.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SJ株(天津分离株)感染仔猪的病理学

选用10～15日龄健康仔猪20头，随机分为攻毒组（15头）与对照组（5头），攻毒组滴鼻接种猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）SJ株，3mL／头；对照组滴鼻接种无PRRSV的细胞培养物，3mL／头。攻毒组的主要临床表现为眼睑水肿、打喷嚏、呼吸急促、嗜睡、体温略升高。攻毒组与对照组在试验开始后24h、7d、14d、21d、28d分别剖杀3头和1头仔猪，采集肺、脾、肾、扁桃体及各部位淋巴结作免疫组化及病理组织学观察；迅速采集肺组织，制作超薄切片，透射电镜观察。试验结果表明，PRRSV SJ株主要感染仔猪的肺脏与脾脏。免疫组化观察，攻毒后24h～7d，肺门淋巴结和扁桃体PRRSV抗原阳性反应最强；攻毒后14～28d，牌睦PRRSV抗原阳性反应最强。攻毒后14～28d，显微病变可见肺组织发生弥漫性、局灶性或间质性肺炎，肺泡隔因巨噬细胞、淋巴细胞及Ⅱ型上皮细胞增生而明显增厚。超微病变主要表现为，肺泡间隔中单核细胞增生，核孔消失，核内有异染色质聚集，Ⅱ型肺泡细胞高度变性等。     

特异性中和抗体终止猪体内猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲型标准株（VR-2332）的ORF6及ORF7部分保守序列，设计合成1对特异引物，通过优化RT—PCR反应条件，建立了从血清中检测PRRSV RNA的RT—PCR诊断方法。60日龄仔猪经鼻腔接种1mL 10^5.6TCID50/／mL PRRSV强毒液，7d后肌肉注射中和效价为1：64的特异性高免血清，每隔1周利用RT—PCR检测猪体内PRRSVRNA，5周内PRRSV RNA检测均为阴性，表明高滴度特异性中和抗体完全终止了PRRSV感染猪体内的病毒复制。     

PRRSV感染仔猪肾组织的超微病理变化分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是能引起仔猪高死亡率的疾病,给养猪业带来极大的经济损失。本研究对PRRSV感染仔猪肾组织的病毒定位及产生的超微病理变化进行观察,以期了解PRRSV对肾组织细胞以及血液循环的影响。主要采用透射电镜技术结合血清生化检测、免疫组织化学染色（IHC）,对仔猪感染PRRSV后肾组织进行超微病理学观察及分析。结果发现,PRRSV感染后引起肾组织损伤,病毒主要分布于肾小球、坏死的肾小管上皮细胞胞质及巨噬细胞胞质内;肾小球内足细胞足突广泛融合或微绒毛化,内皮细胞肿胀;肾小管上皮细胞线粒体肿胀、嵴断裂、溶解;间质炎性细胞浸润。PRRSV通过巨噬细胞内复制随血液扩散至肾组织,引起损伤;根据透射电镜观察结果,足细胞足突融合,肾小球血管内皮细胞损伤引起微血栓形成,说明PRRSV感染仔猪后影响了肾小球滤过率,同时,对肾血液微循环系统造成损伤。本研究为阐明PRRSV的感染致病机制提供理论基础。     

鸭肠炎病毒强毒参考株在感染鸭体内的动态分布研究

为了研究鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）强毒株在感染鸭体内的动态分布规律,根据DEV的gD基因序列设计检测引物RT-gDF和RT-gDR,建立了特异性强、敏感性高、重复性好的检测DEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用已建立的方法,对DEV强毒参考株感染鸭的组织脏器进行了定量检测。结果显示,接种后6 h即可在所有受检组织中检测到DEV DNA,随着病程发展,DNA拷贝数持续升高,直至接种5 d后感染鸭全部死亡。其中结肠病毒DNA拷贝数为最高,达到1013.26 copies,法氏囊、肝脏和盲肠次之,约1012 copies。本研究证实了DEV强毒对感染鸭的免疫器官、神经组织和消化系统均具有广泛的嗜性。     

仔猪繁殖与呼吸综合征病毒和血凝性脑脊髓炎病毒混合感染的诊断

对辽宁省某规模化猪场发病的哺乳仔猪,通过临床症状、血清学、病理学、动物试验和反转录多聚酶链式反应(PCR)方法进行综合诊断,确诊为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrone virus,PRRSV)与猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)混合感染。RT-PCR检测结果证明,所感染的PRRSV为美洲型毒株,猪血凝性脑脊髓炎病毒多呈隐性感染,本猪场哺乳仔猪发生二者混合感染,可能与PRRSV感染猪免疫力降低,容易感染HEV而混合发病有关。     

实验性流行性腹泻仔猪小肠粘膜上皮细胞及肠系膜淋巴结的超微结构

给8头生后3d的哺乳仔猪经口感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)“吉”毒株,于感染后18、30、45和96h各扑杀2头,以透射电镜和扫描电镜观察了小肠粘膜上皮细胞及肠系膜淋巴结的超微结构。结果表明,小肠上皮细胞的病变因感染时间不同而有明显差异。上皮细胞的脱落和残留上皮细胞超微结构的破坏,以感染后30h最严重,病毒在这些上皮细胞内的增殖最显著。感染后45h,见有大量新生上皮细胞修补损伤的肠绒毛。感染后96h,小肠绒毛短缩、粗大乃至发生融合。实验仔猪肠系膜淋巴结内巨噬细胞和淋巴细胞的超微结构均遭到破坏,在巨噬细胞内见有PED冠状病毒粒子。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体的研制

为制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单克隆抗体,用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株免疫BALB/c小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇作用下融合,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,以有限稀释法克隆3次,制备单克隆抗体,并对制备的单克隆抗体进行鉴定。结果表明获得了2株分泌PRRSV膜基质蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1D12、5H5,经鉴定其抗体亚型分别为IgG2b、IgM,2株均为κ链,腹水ELISA效价分别为1∶107和1∶105。该单克隆抗体与PRV、PPV、PCV、CSFV、JEV无交叉反应。作者成功制备了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体,为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。     

应用灭光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布

为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和28 d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测.结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒栽量峰值期出现在感染后7 d,随后呈下降趋势.HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21 d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变.     

免疫组化法检测猪圆环病毒2型在人工感染猪体内的分布

将猪圆环病毒2型（PCV2）BF株经滴鼻接种28日龄健康普通仔猪,于接种后不同时间剖杀,采集相关的器官组织制备组织切片,使用免疫组化方法检测病毒在猪体内的分布。结果显示,淋巴结、脾脏、扁桃体等淋巴组织均出现阳性信号,心、肝、肺、肾、胃、十二指肠、大脑及小脑同样存在阳性细胞,其他组织呈阴性反应。阳性信号主要位于感染细胞的胞质中,偶尔出现在细胞核内。结果表明,PCV2确已造成猪体组织感染。