动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立

为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。     

禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速检测方法的建立

为了建立一种快速、灵敏、简便的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)现场检测方法,本试验将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25～45℃恒温反应15 min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本试验建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测,为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。     

猪细小病毒重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立

试验旨在建立一种简单、快速检测猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）的重组酶聚合酶（recombinase polymerase amplification,RPA）检测方法,为中国PPV的防控和诊断提供一种新的、可靠的技术支持。本研究基于PPV VP2基因的保守序列,设计合成1对RPA引物探针,通过对反应时间的优化,建立38℃恒温水浴锅检测PPV的RPA方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,能够特异性的检测PPV;以重组质粒pPPV-VP2作为模板,RPA的检测限为10²拷贝,同本研究中应用的实时荧光定量PCR方法检测限一致,比普通PCR方法高100倍;RPA方法对疑似PPV感染临床样品的阳性检出率为82.6%,略低于实时荧光定量PCR的检出率（86.9%）,明显高于普通PCR的阳性检出率（66.7%）。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速,结果确实可靠,适用于PPV的快速检测。     

禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡,引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求,建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法,使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物,使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系,优化探针浓度和反应温度,使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验,最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示,建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10¹ copies/反应的ARV RNA,并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料,发现有3份ARV阳性,与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明,本研究建立的ARV RT-R...     

副溶血弧菌重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法.优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果...     

林可霉素胶体金快速检测试纸条的研制

本文利用胶体金免疫层析技术研制了一种快速检测牛奶中林可霉素的试纸条,经过测试,该试纸条的检测限为20μg/L,检测时间为10min,假阳性率和假阴性率均为0,该方法准确,可靠,使用简便,适合大量样品的现场检测。     

鲤春病毒血症病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法,本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针,通过优化反应时间和温度等条件,初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示,该方法可以特异性的检测SVCV,并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应;对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×10²拷贝/μL,并具有较好的稳定性和重复性;采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测,其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品,荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品,本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%,与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的SVCV ...     

重组酶聚合酶扩增技术在疾病快速检测中的研究进展

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是近年来开发的核酸扩增技术,在保证灵敏、特异的同时,操作简单、耗时短,能够在常温下10~20分钟内对靶DNA进行扩增,对实验设备、资源的要求低,适用于兽医、食品安全、生物防御、农业等领域的快速诊断。本文介绍了该技术的原理及目前在病毒、细菌、寄生虫等病原检测方面的应用,展望了其现场检测方面的应用前景。     

非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,基于ASFV P72基因保守序列,设计并合成引物,建立了一种ASFV重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,即可实现对目的片段的有效扩增;以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板,RPA的检测限达到10~2 copies,同世界动物卫生组织(OIE)推荐的实时荧光PCR方法检测限一致,但比OIE推荐方法的检测限高10倍;RPA仅特异性扩增ASFV P72基因,对FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组c DNA或DNA没有扩增。本研究所建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠,为非洲猪瘟的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。     

可视化2型猪链球菌LAMP检测方法的建立

由2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2)引起的猪链球菌病(Swine streptococosis)是一种重要的人兽共患疾病,具有高感染率、高死亡率的特点。为加强口岸动物源性产品中2型猪链球菌的现场查验力度,建立了2型猪链球菌LAMP检测方法,并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了测试。通过在LAMP反应产物中加入显色液,提高了对检测结果肉眼判定的准确性,实现了结果判定可视化的目标,有助于在出入境口岸货物查验现场及猪场等一线实验室使用。     

猪链球菌2型的PCR快速检测

根据猪链球菌 2型的荚膜多糖抗原基因 cps2 J,合成 1对可扩增长度为 6 75 bp目的片段的引物 ,建立了检测猪链球菌 2型的 PCR法。应用 PCR对 9株经玻片凝集试验检测为猪链球菌 2型的菌株进行了检测 ,均呈阳性 ;而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等检测结果均呈阴性 ,表明了本方法的特异性。用此法对 88份正常猪的扁桃体样品的细菌分离物进行了检测 ,36份呈阳性 ,同时用玻片凝集试验进行对照检测 ,也全部呈阳性。而此法不需进行细菌的纯分离培养 ,即可用于猪链球菌 2型的快速诊断以及流行病学调查。     

猪链球菌PCR检测技术研究进展

猪链球菌是猪的一种重要病原菌,并且也会引起人的链球菌病。有35个荚膜血清型(1/21、~34),通常自发病或死亡猪体分离获得1,2,7,9型和14型菌株,其中2型是毒力最强的血清型。根据已知猪链球菌16 SrRNA及溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、胞壁蛋白或溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、胞外因子(epf)编码基因序列设计特异性引物,建立猪链球菌群和1(14),2(1/2),7型和9型特异性PCR或多重PCR,建立2型致病性菌株和1型高致病性菌株毒力鉴定PCR或多重PCR,用于检测和鉴别临床病料和细菌分离物中的猪链球菌,具有高敏感性和高特异性,与其他致病菌及其他血清的猪链球菌型无交叉反应,为疫病诊断及流行病学的研究提供了快速、简便和有用的工具。     

猪链球菌检测及猪链球菌病防治的研究进展

猪链球菌（Streptococcus suis）能引起猪的脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和败血症，并能感染人，是一种重要的人畜共患病病原。国内外许多学者致力于该菌的致病性、快速准确诊断技术以及综合防治研究。本文对猪链球菌的毒力因子、检测方法和疾病防治等方面的研究进展进行了综述。     

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。     

Development of the Recombinase Polymerase Amplification Assay for Rapid Detection of Porcine Parvovirus

This study was aimed to develop a simple and rapid method for the porcine parvovirus (PPV) with recombinase polymerase amplification (RPA), which could be a novel and reliable tool for the control and detect of PPV. The RPA was developed using specific primers for the conserved region of PPV VP2 gene. The reaction time was optimized,the RPA reaction could amplify the PPV, and was performed successfully at 38℃ for 30 min in a water bath. The results showed that the detection limit of RPA was 102 copies of plasmid DNA, which was the same as the Real-time quantitative PCR applied in this study, and 100 times more sensitive than conventional PCR. For the clinical samples from the suspected PPV-infected pigs, the positive detection ratio was 82.6% for RPA, which was lower than that of Real-time quantitative PCR (86.9%), but was much higher than conventional PCR (66.7%). The PPV RPA assay developed in the study was simple, rapid and reliable, and was suitable for rapid detection of PPV.     

猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶序列分析及其PCR检测

对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为1231bp,与Genbank发表的该基因序列相比,核苷酸同源性高于99%,推导的氨基酸同源性高于96%。根据精氨酸脱亚氨酸酶基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法,35株猪链球菌致病株中,30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;14株正常猪扁桃体分离株中,11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各一株,均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因的片段。     

猪链球菌2型荧光PCR检测方法与常规检测方法的比较

为验证猪链球菌2型荧光PCR检测方法对临床样品检测的敏感性和适用性以及该方法所拥有的独特优点,分别用荧光PCR法、常规PCR法和细菌分离法对人工感染猪链球菌2型的小鼠肝脏和发病猪的心、肝、脾、肾等实质器官和血液、喉拭子进行抗原检测。结果显示,荧光PCR法检出率为70.8%,明显高于普通PCR法（检出率为20.8%）,也高于常规细菌分离法（检出率为45.8%）。由于临床样品常常会被其他细菌污染,细菌分离法很难准确分离到链球菌。但荧光PCR法不受其他细菌污染的影响,对实验室培养的猪链球菌2型菌液,该方法检测滴度可达10-6/0.1mL（42～52 CFU/0.1 mL）,而普通PCR方法检测滴度仅为10-4。     

猪链球菌分子生物学分型方法研究进展

猪链球菌是猪重要的致病菌,其种类繁多,鉴定困难。传统分型方法包括兰氏分群法,荚膜抗原分型,溶血性分型及生化分型法等。分子生物学技术的发展给猪链球菌的分型带来新的思路。论文对猪链球菌分子生物学分型方法进行介绍,包括多位点序列分型技术、脉冲场凝胶电泳、扩增片段长度多态性、随机扩增的多态性DNA、限制性片段长度多态性、核糖体分型,PCR-限制性片段长度多态性和测序。