鸡传染性贫血病毒VP2基因的原核表达及兔抗血清的制备

为了用大肠杆菌原核表达系统表达鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP2基因片段,并制备其兔抗血清,试验以CIAV M9905株基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因,与p ET28a(+)载体连接后转化DH5α获得阳性重组子,将其转化E.coli BL21(DE3)菌,IPTG诱导表达出His-VP2重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后免疫新西兰白兔制备兔抗血清,采用IFA和Western-blot检测该血清的特异性,ELISA测定其效价。结果表明:重组His-VP2融合蛋白的分子质量约为36 ku,以包涵体形式存在。制备的兔抗VP2血清效价在1∶6 400以上,可特异性结合真核表达的VP2蛋白,表明其反应原性较好。说明试验成功表达VP2蛋白,并制备出兔抗血清,可用于该蛋白与病毒其他蛋白之间的相互作用的进一步研究。     

鸡传染性贫血病毒VP3基因的原核表达及抗血清制备

为了研究鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)VP3蛋白与病毒自身蛋白之间的相互作用,需对该蛋白进行原核表达制备相应兔源抗血清,试验通过提取CIAV M9905株基因组DNA,PCR扩增出VP3基因,构建重组质粒pET30a(+)-VP3,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,进一步通过IPTG诱导表达后用Ni-NTA亲和柱纯化获得融合蛋白,经SDS-PAGE分析后对融合蛋白进行乳化,免疫新西兰兔制备抗血清,并对其进行ELISA效价测定、Western-blot及IFA检测。结果表明:SDS-PAGE分析证实获得高纯度的重组蛋白VP3,大小约为22 ku,且其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;ELISA法检测制备的兔源抗VP3血清效价在1∶6 400以上;经Western-blot及IFA检测证实,VP3兔源血清可特异性结合Vero细胞表达的VP3蛋白。说明试验成功表达出CIAV VP3蛋白,制备的兔抗血清具有较好的特异性。     

含鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组火鸡疱疹病毒的构建

采用PCR方法，以传染性贫血病毒(CIAV)DNA为模板，扩增并克隆了CIAV的VP1、VP2基因，并进行了序列分析。经基因修饰，将这两个基因分别加上表达元件后连接作为目的基因。通过同源重组技术，将目的基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)gC基因区，构建了一株含CIAV VP1、VP2基因表达单元的重组HVT(VP1VP2-rHVT)：体内、体外传代结果表明该重组病毒性状稳定。采用PCR扩增及Southem blot杂交检测，证实了CIAV VP1、VP2基因的插入。     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析

参考已发表的鸡传染性贫血病毒（CIAV）VP1基因序列，设计并合成了2对引物，经PCR扩增获得了2个基因片段。将PCR产物克隆至pGEM—T Easy载体中，成功构建了克隆载体pGEM—CIAVVP1A和pGEM—CIAVVP1B。将上述重组质粒和原核表达载体pMXB10分别用NdPⅠ＋EcoRⅠ、NdeⅠ十X^0I双酶切，并将纯化的2个基因亚克隆至pMXB10中，构建出原核表达载体pMXB10-VP1A和pMXB10-VPIB。在0．3mmol／L IPTG诱导下，目的基因在大肠杆菌ER2566中以分泌型得到了大量表达。Western—blot分析发现，表达蛋白具有CIAV抗原性。表达蛋白经纯化后作为包被抗原，用间接ELISA鉴定，与CIAV阳性血清均能发生特异性反应。2组蛋白免疫SPF鸡后，用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性，表明2组蛋白均可诱发机体产生抗CIAV的抗体。     

鸡传染性贫血的病原及诊断

1病原 鸡传染性贫血是由鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus,CIAV)引起的,以雏鸡再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血及高死亡率为特征的传染病. 传染性贫血病毒在分类上属于圆环病毒科,圆环病毒属.本病毒呈球形,无囊膜,病毒粒子平均直径约25.0～26.5钠米.核衣壳呈正二十面体,由32个壳粒组成,为典型的5、3、2次轴对称.CIAV的基因组分别为单股、负链、圆环状、共价连接的DNA,由2 300个碱基组成.基因组有3个部分或完全重叠的开放阅读框(ORF),编码3种蛋白质,VP1～3.VP1为CIAV惟一的结构蛋白(衣壳蛋白)和主要免疫原蛋白,分子量为52kD;VP2分子量为24kD,是CIAV的非结构蛋白,参与感染的某些阶段病毒的装配;VP3又称凋亡素,可诱导感染细胞的凋亡,分子量为13kD.     

鸡传染性贫血病毒vp3基因在真核细胞中的表达与功能分析

为研究鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP3蛋白在宿主细胞中的作用,本研究采用PCR技术从CIAV DNA中扩增出vp3基因,并将该基因克隆到p MD18-T simple vector中。经测序证实所克隆的vp3基因与CIAV CUX-1标准株相同。并将vp3基因亚克隆到真核表达载体p EGFP-N1中,构建了重组真核表达质粒p EGFP-vp3与p CMV-Myc vp3,转染BHK-21和293 T细胞,经RT-PCR、荧光显微镜以及Western Blot证实转染的真核细胞能够表达VP3蛋白。以台盼蓝染色法检测细胞死亡,结果表明,VP3蛋白具有较强诱导细胞死亡的作用。该结果为深入研究CIAV的致病机理奠定了基础。     

IBDV血清Ⅱ型VP5蛋白原核表达及型特异性单克隆抗体的制备

本实验构建表达了传染性法氏囊病病毒(IBDV)血清Ⅱ型23/82株VP5蛋白,并制备出能够区分不同血清型IBDV的单克隆抗体(mAb).利用EcoR I和Xho I双酶切pUC57-23/82VP5质粒,获得23/82株IBDV VP5基因片段,连接到同样处理的原核表达质粒pET-28a,经酶切鉴定获得重组质粒pET-23/82VP5,转化到宿主茵BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白,SDS-PAGE分析表明该融合蛋白分子量大小约为23 ku.Ni-NTA柱纯化重组蛋白,复性后免疫8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,常规方法进行细胞融合,获得1株阳性杂交瘤细胞株(5D3),IFA和western blot分析表明该细胞株分泌的mAb仅与血清II型IBDV 23/82株VP5反应,不与血清I型IBDV Gt株VP5反应.腹水抗体间接ELISA效价为1×104.该mAb的制备为研究血清II型IBDV的VP5的功能和标记疫苗的研制奠定了基础.     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备CIAV VP2单克隆抗体,将原核表达的His-VP2融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将原核表达的GST-VP2融合蛋白作为包被抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗CIAV VP2蛋白的杂交瘤细胞克隆,分别命名为3D7、3B8、2D3。经间接ELISA测定,以上3株杂交瘤细胞腹水效价分别为1:8.0×10~5、1:4.0×10~5,以及1:6.4×10~6,亲和力解离常数分别为7.34×10~(-11)、2.65×10~(-11),以及2.98×10~(-11)。IgG亚类分别为IgG1、IgG2b以及IgG2b。经Western Blot试验证明,3D7株单抗能特异地识别CIAV VP2蛋白,其识别的抗原表位区域为VP2 N-端的20~40 aa。经IFA试验证明,3株单抗均能识别天然的CIAVVP2蛋白。此单抗为研究CIAVVP2的生物学功能和CIAV致病机理奠定基础。     

犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定

犬细小病毒(CPV)编码的VP2基因容易发生变异,导致病毒嗜性和致病性的改变。为制备一株高致病性的CPV毒株(NY株,基因型为2a型)重组VP2蛋白,构建重组原核表达载体pET28a-CPVVP2,转化E.coli BL21(DE3)表达菌株,通过不同温度、不同IPTG浓度和不同诱导时间等条件的优化进行表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果表明,重组CPV-NY毒株VP2蛋白(rVP2)的分子质量约为72ku,在不同温度条件下均以包涵体形式存在,在37℃条件下以终浓度为0.2mmoL/L IPTG诱导4h表达量达到最高。rVP2不仅与His标签mAb反应,也能与CPV特异性阳性血清反应,说明rVP2具有良好的反应原性,为CPV抗体检测试剂盒和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。     

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白的原核表达及其单克隆抗体的研制

本研究首先利用同源重组一步克隆法将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)的VP3基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体上,经IPTG诱导及SDS-PAGE分析成功获得了重组蛋白rGST-VP3的表达.随即以纯化的重组蛋白rGST-VP3免疫Balb/c小鼠,通过脾细胞与SP2/0细胞融合以及间接免疫荧光(IFA)筛选,获得2株稳定分泌CIAV-VP3抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8;亚型鉴定表明,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均为IgG1;效价测定发现,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水间接免疫荧光效价分别为1:102400与1:12800;Western blot进一步证实,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别重组蛋白rGST-VP3.本研究结果为后期研究VP3蛋白在CIAV致病中作用及其诱导凋亡分子机制奠定了坚实的物质基础.     

鸡传染性法氏囊病病毒VP3蛋白的原核表达及其B细胞抗原表位鉴定

为鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP3蛋白中的B细胞抗原表位,本研究将IBDV的VP3基因亚克隆于pET-28a中,构建了表达重组质粒pETVP3,经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)中表达了重组蛋白(rVP3).Western blot鉴定表明,rVP3能被IBDV抗血清特异性识别.同时,根据IBDV VP3的氨基酸序列,合成覆盖VP3全序列的重叠多肽,并与载体蛋白BSA藕联制备多肽人工结合抗原.Peptide-ELISA和Dot-ELISA检测结果表明VP3中有2个线性表位可以被已制备的单克隆抗体(MAb)识别,即~(728)PRDWDRLPYLNL~(739)和~(982)PKPKPKPNAPTQ~(993);Dot-ELISA结果显示,在VP3中还存在另外4个线性多克隆抗体识别位点:~(818)SLANAPQAGSKSQRA~(831),~(851)QREKD TIUSKKMETMGIYFATP~(872),~(876)ALNGHRGPSPGQLKYWQNTREI~(897)和~(961)QMKDLLLTAMEMK~(973).这些抗原表位的鉴定为开发IBD表位疫苗奠定了基础.     

Production and characterization of two serotype independent monoclonal antibodies against foot-and-mouth disease virus

Two foot-and-mouth disease virus (FMDV) monoclonal antibodies (mAbs) were produced from mice immunized with either FMDV serotype A, subunit (12S) or FMDV serotype O, whole virus (140S). Both mAbs (F1412SA and F21140SO) recognized all seven serotypes of FMDV in a double antibody sandwich (DAS) ELISA, suggesting that the binding epitopes of the two mAbs are conserved between serotypes. These mAbs are IgG1 isotype and contain kappa light chains. In order to define the mAb binding epitopes, the reactivity of these mAbs against trypsin-treated and denatured FMDV were examined using an indirect ELISA. The binding site of the mAb, F1412SA is trypsin sensitive and the epitope is linear. Both ELISA and Western blot results suggested that the polypeptide VP2 contributed to the immunodominant site. This mAb showed reactivity to VP2 peptide (DKKTEETTILEDRIL). The mAb, F21140SO, recognized an epitope which is trypsin resistant and discontinuous. This mAb binding to FMDV is dependent on conformational structures of intact viral (140S) or subunit (12S) particle, since it failed to recognize any viral protein in Western blot. This conformational and highly conserved epitope is the first identified epitope among all seven FMDV serotypes. Because the use of mAbs increases the specificity, accuracy and efficiency of diagnostic tests compared to polyclonal antisera, these two mAbs with different specificities are suitable for type-independent diagnosis of FMDV, such as DAS ELISA, or could be adapted to immuno-chromatographic or flow-through rapid test.     

1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定

旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞,并以细胞表达的方法制备单克隆抗体;采用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)对单克隆抗体的特异性进行鉴定。利用IEDB表位预测软件对p30蛋白B细胞抗原表位进行预测,根据预测结果对CP204L基因进行截短表达,利用IFA、Western blot和iELISA对其抗原表位进行鉴定。最后,利用噬菌体十二肽库对制备的p30单克隆抗体进行4轮生物淘选,筛选多肽表位,并与上述基因截短表达筛选方法进行比对。特异性鉴定结果显示,该单克隆抗体能成功识别感染猪肺泡巨噬细胞的ASFV;基因截短表达筛选结果表明,其识别的抗原表位区域为⁸⁴M～K¹⁴²;噬菌体淘选试验结果表明,¹¹⁶TSSFETLFE¹²⁴为本试验制备的单克隆抗体所识别的p30蛋白抗原表位核心序列,该结果进一步缩小了表位分布范围。本研究制备了p30蛋白的1株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为血清学诊断试剂的研发和p30蛋白功能研究奠定基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示：成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综...     

Molecular cloning, expression and first antigenic characterization of human astrovirus VP26 structural protein and a C-terminal deleted form

The open reading frame 2 (ORF2) of human astrovirus (HAstV) encodes the structural VP26 protein that seems to be the main antigenic viral protein. However, its functional role remains unclear. Bioinformatic predictions revealed that VP29 and VP26 proteins could be involved in virus-cell interaction. In this study, we describe for the first time the cloning and expression in Escherichia coli (E. coli) of a recombinant VP26 (rVP26) protein and a VP26 C-terminal truncated form (VP26 Delta C), followed by purification by NTA-Ni(2+) agarose affinity chromatography. Protein expression and purification were evaluated by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot (WB). Then, the purified proteins were evaluated for antigenic properties in enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using a polyclonal antibody (PAb) and a neutralizing monoclonal antibody (nMAb) named PL2, both of them directed to HAstV. The results presented herein indicate that the C-terminal end of the VP26 protein is essential to maintain the neutralizing epitope recognized by nMAb PL2 and that the N-terminus of VP26 protein may contain antigenic lineal-epitopes recognized by PAb. Thus, these recombinant proteins can be ideal tools for further antigenic, biochemical, structural and functional VP26 protein characterization, in order to evaluate its potential role in immunodiagnosis and vaccine studies.     

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段（P97CR1）作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化

参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。     

禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备禽腺病毒血清4型（FAdV-4）纤突蛋白（Fiber2）的特异性单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）和Western blot鉴定该单抗的特异性。用制备的单抗包被酶标板,通过一系列的优化,建立了FAdV-4 Fiber2双抗夹心ELISA检测方法。通过逐步截短分析鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明：成功获取3株单克隆细胞株2G5、2G8、4C2。MAb 2G5可与原核表达纯化的Fiber2蛋白及FAdV-4特异性反应。建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性。该MAb识别的表位序列是N端aa1—33。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的单克隆抗体,为Fiber2蛋白功能研究和FAdV-4新型表位疫苗商品化研发奠定了基础。     

鸡Toll样受体15单克隆抗体的制备及其初步应用

旨在制备鸡Toll样受体15 (ChTLR15)的特异性单克隆抗体(mAb),并初步应用.利用PCR技术扩增ChTLR15第162-386位氨基酸,克隆于载体pET-30a中进行诱导表达,获得高纯度的重组ChTLR15 (162-386 aa)蛋白.然后采用皮下多点注射方式将ChTLR15免疫6周龄的雌性BALB/c小...