鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备CIAV VP2单克隆抗体,将原核表达的His-VP2融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将原核表达的GST-VP2融合蛋白作为包被抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗CIAV VP2蛋白的杂交瘤细胞克隆,分别命名为3D7、3B8、2D3。经间接ELISA测定,以上3株杂交瘤细胞腹水效价分别为1:8.0×10~5、1:4.0×10~5,以及1:6.4×10~6,亲和力解离常数分别为7.34×10~(-11)、2.65×10~(-11),以及2.98×10~(-11)。IgG亚类分别为IgG1、IgG2b以及IgG2b。经Western Blot试验证明,3D7株单抗能特异地识别CIAV VP2蛋白,其识别的抗原表位区域为VP2 N-端的20~40 aa。经IFA试验证明,3株单抗均能识别天然的CIAVVP2蛋白。此单抗为研究CIAVVP2的生物学功能和CIAV致病机理奠定基础。     

抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。     

鸡贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

鸡贫血病毒是鸡传染性贫血病的病原体，它广泛存在于世界各地，成为危害养禽业的主要病原之一。鸡贫血病毒基因组含有3个开放阅读框架，分别编码分子量为51.6kDa（VP1）、24kDa（VP2）和13．6kDa（VP3）的3种蛋白质。本文将克隆化VP2基因亚克隆到PET-32a（＋）载体上并进行原核表达，用PET-32a（＋）表达的VP2融合蛋白免疫Balb/c小鼠，经过杂交瘤细胞的建立、融合细胞的筛选和克隆化培养，获得一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3C5。腹水单克隆抗体的ELISA效价为1：409600，经Western—blotting证明单抗3C5为针对VP2融合蛋白的单抗。为VP2融合蛋白的纯化和鸡贫血病毒的检测、鉴定和奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白的原核表达及其单克隆抗体的研制

本研究首先利用同源重组一步克隆法将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)的VP3基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体上,经IPTG诱导及SDS-PAGE分析成功获得了重组蛋白rGST-VP3的表达.随即以纯化的重组蛋白rGST-VP3免疫Balb/c小鼠,通过脾细胞与SP2/0细胞融合以及间接免疫荧光(IFA)筛选,获得2株稳定分泌CIAV-VP3抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8;亚型鉴定表明,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均为IgG1;效价测定发现,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水间接免疫荧光效价分别为1:102400与1:12800;Western blot进一步证实,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别重组蛋白rGST-VP3.本研究结果为后期研究VP3蛋白在CIAV致病中作用及其诱导凋亡分子机制奠定了坚实的物质基础.     

禽传染性支气管炎病毒S2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备禽传染性支气管炎病毒(IBV) S2蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化重组S2蛋白,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到4株能够稳定分泌S2蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7、4F12、4A7、4D1。亚类鉴定结果显示4株MAb的重链均为Ig G1,轻链均为κ。采用间接ELISA法检测上清及腹水效价,结果显示MAb细胞上清效价均不低于1∶12 800,腹水效价均不低于1∶51 200。采用western blot检测制备的S2蛋白MAb与IBV感染鸡胚尿囊液后天然表达的S2蛋白的反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测IBV感染非洲绿猴肾细胞(Vero)后天然表达的S2蛋白的反应原性。Western blot结果显示,感染IBV的鸡胚尿囊液中出现了90 ku左右的特异性条带;IFA结果显示,感染IBV的Vero细胞中出现绿色荧光。以上结果表明,制备的S2蛋白MAb能够与天然表达的S2蛋白反应,反应原性较强。利用间接ELISA检测MAb与S2蛋白的亲和力,结果显示4株MAb对S2蛋白均有良好的亲和力。利用一系列表达部分重叠的重...     

猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其识别表位分析

为获得针对猪源EMCV结构蛋白VP2的特异性单克隆抗体,本试验以EMCV结构蛋白VP2为对象,将EMCVBJC3株VP2基因定向插入穿梭质粒中,构建重组腺病毒AdV—VP2,免疫BALB／c小鼠制备单克隆抗体,利用Pepscan技术对单抗识别的抗原位点进行分析。结果显示,间接ELISA及间接免疫荧光法筛选获得了2个阳性细胞克隆株,命名为C11和G8。经检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：1600,腹水效价分别为1：2．56×106和1：1.28×106,中和试验鉴定均无中和活性。Western—blot鉴定表明获得的2株单抗均能识别原核表达的重组VP2蛋白。亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG2b亚类,轻链均为κ型。Pepscan分析结果显示,这2株单抗可分别识别EMCVVP2蛋白上的2个B细胞线性表位。本研究获得的蛋白十分接近于其天然构象,很大程度上保证了病毒表面抗原位点的结构和功能。     

抗鸡传染性法氏囊病病毒VP3单克隆抗体制备及抗原表位的初步分析

用纯化的原核表达的IBDV VP3蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次有限稀释,获得分泌抗IBDV VP3抗体的4株(HRB-7B、HAR-7C、HRB-3F、HRB-10E)杂交瘤细胞系。结果表明,4株杂交瘤细胞分泌的抗体均能够特异地与IBDV VP3蛋白反应,细胞上清ELISA效价均在5.0×102以上,腹水ELISA效价为6.4×106以上;相加ELISA及肽扫描结果表明,4株中仅HRB-7C和HRB-10E 2株单抗针对的抗原表位相近,并利用肽扫描的方法初步定位4株单克隆抗体的抗原表位。本研究对进一步分析IBDV的结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义。     

蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10.Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/k链.Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白.间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应.利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546.本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础.     

禽传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体制备及其中和抗原表位的鉴定

为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位,本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠,经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为10⁶以上,Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株,同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测,发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后,在抗原表位和Western blot分析的基础上,鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域,获得了6个中和抗原表位,其中除⁴¹⁶IQTRTEP⁴²²表位,其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体,不仅丰富了IBV的单克隆抗体库,为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料...     

鸡传染性贫血病毒VP1和VP2基因共表达载体的构建

根据GenBank中收录的鸡传染性贫血病毒(CIAV)基因组序列,设计了扩增CIAV VP1和VP2基因的特异性引物,运用PCR技术从发病鸡肝组织DNA中扩增得到VP1、VP2基因,并将其克隆至pMD18-T载体.核苷酸测序结果显示,其序列与发表的序列同源性达到99.8%.将VP2基因克隆到pMD18-T载体,并对Vp3基因起始密码子进行定点突变,得到突变基因mVP2.将mVP2、VP1先后克隆至pIRES载体,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定显示,成功获得了共表达质粒pIRES-VP1/mVP2.     

鸡传染性支气管炎病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

为获得鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)N蛋白的单克隆抗体,通过原核表达IBV N蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株,命名为1#、18#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的3株单克隆抗体亚型均为IgG1,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与IBV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。本研究成功制备了IBV单克隆抗体,为进一步建立IBV检测方法和深入研究IBV的生物学特性奠定了基础。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

为获得禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白的单克隆抗体,通过原核表达AEV VP1蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得2株杂交瘤细胞株,命名为4#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的株单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG2a,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与AEV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。运用建立的IFA对单抗进行了初步运用,在外源病毒检测方面与经典方法符合率高。本研究成功制备了AEV单克隆抗体,为进一步建立AEV检测方法和深入研究AEV的生物学特性奠定了基础。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及活性鉴定

为制备兔出血症病毒VP60单克隆抗体,利用HEK293T细胞瞬时表达VP60,免疫Balb/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选获得阳性克隆细胞株-5D11。利用血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)和Westernblot等方法对5D11分泌的单克隆抗体活性进行鉴定,并对其识别区域进行了定位。结果显示,5D11能抑制病毒凝集人“O”型红细胞,与杆状病毒表达的VP60蛋白发生特异性抗原抗体反应,且其识别VP60蛋白线性抗原表位,并定位于494aa-579aa区段。成功制备了抗VP60蛋白单克隆抗体,为开展病原学检测、流行病学研究等奠定了基础。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及活性鉴定

为制备兔出血症病毒VP60单克隆抗体,利用HEK293T细胞瞬时表达VP60,免疫Balb/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选获得阳性克隆细胞株-5D11。利用血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)和Westernblot等方法对5D11分泌的单克隆抗体活性进行鉴定,并对其识别区域进行了定位。结果显示,5D11能抑制病毒凝集人“O”型红细胞,与杆状病毒表达的VP60蛋白发生特异性抗原抗体反应,且其识别VP60蛋白线性抗原表位,并定位于494aa-579aa区段。成功制备了抗VP60蛋白单克隆抗体,为开展病原学检测、流行病学研究等奠定了基础。     

一株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其致病性研究

从北京某鸡场发生疑似鸡传染性贫血病毒(CAV)感染的鸡只病料中分离到了一株CAV,通过PCR和全基因组测序等方法对其进行了鉴定,命名为AV1550。将其全基因组序列与NCBI上的参考毒株序列进行同源性比对和进化分析,结果显示AV1550株与CAV参考毒株的同源性在91.7%~99.7%,与中国分离株LN15170的亲缘关系最近。VP1序列分析表明AV1550在75、89、125、141和394位氨基酸均为强毒株特征。1日龄SPF鸡经胸部肌肉途径接种含10000 EID50的AV1550病毒液后,接种鸡只出现明显的贫血症状,增长迟缓,死亡率高达50%,表明AV1550是一株具有较强致病性的CAV野毒株。     

虎源猫瘟热病毒VP2蛋白特异性单克隆抗体的制备

以原核表达的虎源猫瘟热病毒(FPV)VP2蛋白作为免疫抗原,免疫6周龄BALB/c小鼠,用FPV全病毒作为筛选抗原,采用淋巴细胞杂交瘤技术,经过有限稀释法获得了1株可稳定分泌抗虎源FPVVP2蛋白的杂交瘤细胞株3C4。间接ELISA方法测定3C4株单抗腹水效价为1∶12800,亚类鉴定为IgG2a类型,间接免疫荧光试验显示该株单抗能与虎源FPV发生反应,而免疫印迹试验该株单抗未见特异性反应带。     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。     

浅谈鸡传染性贫血

本文介绍了由鸡传染性贫血病病毒侵害雏鸡骨髓、胸腺和法氏囊导致免疫抑制的一种疾病——鸡传染性贫血病,系统论述了自1979年以来国内外学者对该病病原、流行状况、临床诊断、病原学诊断、防治措施的研究概况.