miR-18a-5p在鸡不同生长时期的表达及其生物信息学分析与靶基因预测

为探究miR-18a-5p在鸡不同生长时期组织表达变化规律及其生物信息学特点,本研究以苏禽3号鸡为试验动物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-18a-5p的组织表达变化。通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-18a-5p序列,利用Ensembl数据库确定miR-18a-5p在基因组中的位置,根据成熟序列构建系统进化树;使用miRmap、microT、miRanda和TargetScan网站预测miR-18a-5p靶基因,并进行GO和KEGG分析。组织表达分析结果显示,miR-18a-5p序列在鸡心脏、脾脏、肾脏和下丘脑中的表达量显著高于除大脑以外的其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄鸡心脏、脾脏、肾脏、腿肌和下丘脑中miR-18a-5p的表达量均显著上升(P<0.05)。在50种脊椎动物中共发现52条miR-18a-5p序列,几乎所有物种都只有1条成熟序列;基因定位分析发现,鸡miR-18a-5p位于1号染色体上的基因间隔区。多序列比对分析表明,不同物种miR-18a-5p的成熟序列同源性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,鸡miR-18a-5p与原鸽、斑胸草雀等其他鸟类聚为一类,这表明miR-18a-5p进化过程中是保守的。靶基因预测和功能分析发现,miR-18a-5p共有121个靶基因。GO分析结果显示,靶基因主要富集到蛋白质泛素化、细胞周期阻滞、白细胞介素-6产生的负调控等功能。KEGG 通路分析表明,靶基因主要富集到细胞周期及Wnt和FoxO信号通路等。多个与肌肉生长及细胞增殖等相关的基因富集到相关通路之上。综上,鸡miR-18a-5p是组织广泛表达的miRNA,其可能通过Wnt及FoxO信号通路调控肌肉生长及细胞增殖分化。本研究为miR-18a-5p功能及调控机制的深入研究提供参考依据。     

miR-148a-3p靶向PPARγ基因抑制鹅颗粒细胞孕酮的合成

旨在探究miR-148a-3p是否通过靶基因PPARγ调节鹅卵泡颗粒细胞中类固醇激素的合成。本研究选用12只健康的处于产蛋高峰期的天府肉鹅母系母鹅分别用于组织样品采集和颗粒细胞培养。利用qPCR检测miR-148a-3p在鹅不同阶段卵泡颗粒层中的表达;通过MEGA 7软件分析miR-148a-3p在不同物种的保守性,预测miR-148a-3p的靶基因,采用双荧光素酶报告试验验证miR-148a-3p与靶基因的靶标关系;在鹅颗粒细胞中转染miR-148a-3p mimics和inhibitor,qPCR检测miR-148a-3p对靶基因及其下游基因表达水平的影响;同时利用ELISA技术检测激素含量的变化。结果表明,miR-148a-3p在不同物种中高度保守;在鹅卵泡发育过程中,miR-148a-3p的表达量随卵泡直径的增加呈先升高后下降的趋势。在鹅卵泡颗粒细胞体外培养过程中,miR-148a-3p mimics能显著下调3β-HSD的表达（P<0.05）,抑制孕酮的合成（P<0.05）;而miR-148a-3p inhibitor的作用则相反（P<0.05）。生物信息学分析和双荧光素酶报告试验证实,PPARγ为miR-148a-3p的靶基因。在颗粒细胞中,miR-148a-3p mimics能显著降低PPARγ的表达（P<0.05）,而miR-148a-3p inhibitor能显著上调PPARγ的表达（P<0.05）。当干扰PPARγ后,3β-HSD的表达量显著降低（P<0.05）,孕酮的含量也降低。这些结果表明,在鹅等级卵泡颗粒细胞中,miR-148a-3p可靶向结合PPARγ来抑制3β-HSD的表达,从而降低颗粒细胞孕酮的合成。     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

鸡miR-10b-5p生物信息学及组织表达分析

【目的】 通过对苏禽3号肉鸡的miR-10b-5p进行靶基因预测、生物信息学分析及其在鸡不同生长时期组织表达变化规律研究,探索其在鸡肌肉生长发育中作用。【方法】 通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-10b-5p序列,利用Ensembl数据库查询并确定miR-10b-5p在基因组中的位置,根据前体序列构建系统进化树;使用miRDB、microT和TargetScan网站预测miR-10b-5p靶基因,并对靶基因进行GO功能和KEGG通路分析,进而揭示miR-10b-5p的基因功能。采用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-10b-5p组织表达量,探索其在大脑、小脑、垂体、下丘脑、胸肌、腿肌、卵巢、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中表达变化。【结果】 miRBase检索共获得59种动物59条miR-10b-5p序列,即每一种动物都只有一种miR-10b-5p形式。基因定位分析发现,鸡miR-10b-5p位于2号染色体上的HOX基因家族中。常见物种miR-10b-5p成熟序列比对分析结果表明,miR-10b-5p的成熟序列相似性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,miR-10b在哺乳类中的灵长目、啮齿目、鸟类、鱼类中各自先聚为一支,然后再共同聚为一类,这表明miR-10b在进化过程中是保守的。靶基因预测发现,miR-10b-5p共有300个靶基因。GO功能分析发现,靶基因主要富集到染色质组装和基因表达的转录后调控、组蛋白甲基转移酶复合物、转录因子复合物等功能。KEGG通路分析表明,靶基因主要富集到Wnt和p53信号通路上。组织表达分析显示,miR-10b-5p在检测的各个组织中均有表达;3日龄时大脑、小脑、垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量显著高于心脏、下丘脑、肾脏和肺脏等组织(P<0.05);90日龄时,垂体、胸肌、腿肌和大脑中miR-10b-5p表达量显著高于其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄时垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量均显著上升(P<0.05)。【结论】 鸡miR-10b-5p是组织广泛表达的miRNA,miR-10b在进化过程中是保守的,其可能通过Wnt及p53信号通路调控肌肉细胞增殖分化,进而调控鸡肌肉生长发育。     

静原鸡let-7a-5p的靶基因预测及组织表达分析

【目的】了解let-7a-5p的生物学信息,初步探索其在静原鸡肌肉组织中的功能作用。【方法】利用生物信息学方法对转录组测序获得的静原鸡let-7a-5p的成熟序列进行保守性分析,使用miRDB、TargetScan和miRanda在线软件预测let-7a-5p的靶基因,取其交集进行GO功能和KEGG通路富集分析,并利用实时荧光定量PCR检测let-7a-5p在静原鸡公鸡和母鸡各组织中的表达水平。【结果】let-7a-5p的成熟序列在各物种间高度保守,共预测得到38个基因集合。在生物过程、细胞组分和分子功能中靶基因富集较多的GO条目有细胞过程、生物调节、细胞、结合和催化活性;靶基因显著富集于聚酮糖单元生物合成、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解、TGF-β信号通路和加压素调节的水重吸收信号通路,且富集最多的是代谢途径、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路。let-7a-5p-靶基因互作主要通过作用于靶mRNA的3′-UTR抑制表达或使其降解。组织表达发现,let-7a-5p在静原鸡公、母鸡的心脏、肝脏、脾脏、...     

北京鸭MYL3基因的生物信息学分析及其原核表达

肌球蛋白轻链3(Myosin Light Chain 3,MYL3)属于MYLs家族,能够维持细胞结构及功能、保持肌球蛋白构型。本研究扩增了北京鸭胸肌组织MYL3基因的CDS区序列,在此基础上使用生物信息学分析网站进行序列分析,下一步构建MYL3原核表达载体,将重组质粒导入E.coli BL21(DE3),利用IPTG诱导表达,最后使用SDS-PAGE凝胶电泳技术检测MYL3原核表达蛋白。结果表明：鸭MYL3基因开放阅读框大小为582 bp,编码193个氨基酸,日本鹌鹑、雉鸡和鸡的氨基酸序列与鸭亲缘关系最近,其次是鸵鸟,最后是人和猪。MYL3蛋白的相对分子质量为21800.01u,等电点为5.13,不稳定性系数为42.5,是一种不稳定且呈酸性的蛋白,总体平均亲水系数高达-0.727,不属于疏水性蛋白。另外,此蛋白是细胞质蛋白,无信号肽和跨膜结构,存在14个磷酸位点和2个N-糖基化位点;该蛋白具有的二级结构中比例最高的是α-螺旋,最低的是β-转角。本实验完成了大小为664 bp的MYL3基因片段的扩增,pET-32a(+)-MYL3重组质粒通过BamH I和Sac I双酶切后,分别形成了...     

LRTN4RL1-AS通过miR-27a-3p靶向PPARγ调节奶牛乳腺细胞乳脂合成

旨在探究lncRNA-LRTN4RL1-AS/miR-27a-3p/PPARγ轴在奶牛乳脂合成中的作用及其调控机制。本研究以奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, BMECs)为试验对象,对处理组与对照组进行3个生物学重复,通过实时荧光定量(real time quantitative PCR, RT-qPCR)、WB(Western blot)、油红O染色和甘油三酯检测、双荧光素酶报告等技术检测lncRNA-LRTN4RL1-AS对BMECs中甘油三酯积累及脂质合成相关基因表达量的影响,验证LRTN4RL1-AS-miR-27a-3p-PPARγ存在内源竞争RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)的靶向关系。结果表明,LRTN4RL1-AS主要在细胞质中表达,干扰LRTN4RL1-AS后显著抑制了BMECs的脂滴形成和甘油三酯积累(P<0.05),显著下调脂质合成相关基因CEBPα(P<0.01)、CEBPβ(P<0.01)和PPARγ(P<0.05)表达,且显著上调脂质分解基因HS...     

黔北麻羊PPP3CA基因克隆、生物信息学分析及不同组织表达研究

为克隆获得黔北麻羊PPP3CA基因的编码序列进行生物信息学分析并探究PPP3CA基因在黔北麻羊不同组织中的表达情况,本实验应用RT-PCR克隆PPP3CA基因的CDS区序列,构建pMD19-T-PPP3CA亚克隆载体,用实时荧光定量PCR法检测黔北麻羊PPP3CA基因在心、肝、脾、肺、肾、背最长肌6个组织中的表达水平。结果显示:黔北麻羊PPP3CA基因CDS区序列全长为1 566 bp,编码521个氨基酸,理论等电点为5.58;黔北麻羊PPP3CA蛋白属亲水性、非跨膜蛋白,二级结构分析显示其主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构预测与二级结构结果相符。黔北麻羊PPP3CA基因核苷酸序列与绵羊同源性最高;PPP3CA基因在黔北麻羊不同组织中均有表达,在背最长肌组织中表达量极显著高于其他组织,背最长肌组织表达量极显著高于其他组织。本实验揭示了PPP3CA基因在黔北麻羊的表达差异并初步分析了其生物学功能,为进一步探究PPP3CA基因对山羊的生长发育奠定基础。     

小鼠NIS蛋白的生物信息学特征及其在乳腺中的表达分析

为探究小鼠钠碘转运体（Na⁺/I^- symporter,NIS）蛋白的结构、功能及其在乳腺组织的表达特征,本研究扩增小鼠乳腺NIS基因编码区,测序鉴定后采用结构预测软件对NIS蛋白进行生物信息学分析,同时采用Western blotting、免疫组织化学技术和半定量PCR技术对NIS基因在不同乳腺发育时期的转录和表达水平进行分析。结果显示,小鼠NIS基因编码区全长1 857 bp,与人NIS的同源性为80.40%,保守性较强。NIS蛋白含有618个氨基酸残基,分子质量约为65.7 ku,分子式为C₂₉₉₆H₄₇₀₁N₇₄₉O₈₃₃S₃₂,理论等电点为7.44,半衰期为30 h,消光系数为102 510,不稳定系数为29.31,脂溶系数为105.91,富含疏水性氨基酸,为稳定的疏水蛋白。NIS蛋白二级结构含有α-螺旋（41.42%）、延伸链（18.28%）、β-转角（4.05%）和无规则卷曲（36.25%）,三级结构与之相一致。Western blotting结果显示,4个时期均出现特异性杂交带,大小为65.7 ku,与预期结果相符。免疫组织化学结果表明,NIS蛋白在小鼠的青春期、妊娠期到泌乳期的乳腺组织中表达量逐渐增加,在泌乳期达到高峰,存在显著差异（P<0.05）,在退化期逐渐恢复到类似青春期状态;NIS基因mRNA的变化规律与蛋白表达一致。本研究结果为进一步探究NIS蛋白在乳腺发育和泌乳调控中的作用提供了参考依据。     

猪miR-199a-5p对脂质生成的影响及其靶基因的预测和分析

本研究旨在分析miR-199a-5p对猪肌内脂肪细胞脂质生成的影响及作用机制。采集淮南猪不同育肥时期(育肥前期、中期和后期)的背最长肌和皮下脂肪组织,通过实时荧光定量PCR分析其表达变化趋势;合成miR-199a-5p的mimics,转染猪原代肌内脂肪细胞,诱导分化后通过油红O染色观察过表达miR-199a-5p对脂质生成的影响;结合之前筛选到的脂肪型和瘦肉型猪差异表达mRNAs、lncRNAs和circRNAs,使用miRanda软件筛选miR-199a-5p的靶分子,并用GO和KEGG富集分析法对这些mRNAs、lncRNAs的共表达基因和circRNAs的来源基因进行功能分析。结果显示,随着育肥进程,miR-199a-5p在背最长肌中表达量持续上调,而在皮下脂肪组织中表达量先下调后上调;过表达miR-199a-5p可抑制肌内脂肪细胞的脂质生成。共筛选到9个mRNAs、5个lncRNAs和1258个circRNAs包含miR-199a-5p结合位点,GO分析主要富集于内质网和肌动蛋白结合,KEGG分析发现主要富集于糖、脂质和蛋白质代谢。提示miR-199a-5p可能通过与lncRNAs和circRNAs互作间接调控靶基因,参与调控肌肉发育、脂质生成和代谢,可作为影响肉质性状的候选miRNA。     

猪miR-199a-5p对脂质生成的影响及其靶基因的预测和分析

本研究旨在分析miR-199a-5p对猪肌内脂肪细胞脂质生成的影响及作用机制。采集淮南猪不同育肥时期（育肥前期、中期和后期）的背最长肌和皮下脂肪组织,通过实时荧光定量PCR分析其表达变化趋势;合成miR-199a-5p的mimics,转染猪原代肌内脂肪细胞,诱导分化后通过油红O染色观察过表达miR-199a-5p对脂质生成的影响;结合之前筛选到的脂肪型和瘦肉型猪差异表达mRNAs、lncRNAs和circRNAs,使用miRanda软件筛选miR-199a-5p的靶分子,并用GO和KEGG富集分析法对这些mRNAs、lncRNAs的共表达基因和circRNAs的来源基因进行功能分析。结果显示,随着育肥进程,miR-199a-5p在背最长肌中表达量持续上调,而在皮下脂肪组织中表达量先下调后上调;过表达miR-199a-5p可抑制肌内脂肪细胞的脂质生成。共筛选到9个mRNAs、5个lncRNAs和1 258个circRNAs包含miR-199a-5p结合位点,GO分析主要富集于内质网和肌动蛋白结合,KEGG分析发现主要富集于糖、脂质和蛋白质代谢。提示miR-199a-5p可能通过与lncRNAs和circRNAs互作间接调控靶基因,参与调控肌肉发育、脂质生成和代谢,可作为影响肉质性状的候选miRNA。     

miR-21a-5p对PHEV复制的影响及其靶基因Cntfr的验证

为研究猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)感染过程中宿主miR-21a-5p对PHEV复制的影响,利用荧光定量PCR方法对PHEV感染过程中细胞内miR-21a-5p的表达变化进行了检测;之后,将化学合成的miR-21a-5p模拟体或抑制剂转染N2a细胞,接种PHEV后利用荧光定量PCR方法检测PHEV基因组RNA的含量。通过TargetScan、Microcosm和Miranda数据库预测miR-21a-5p的靶基因,并利用双荧光素酶报告系统对预测的靶基因进行验证。结果显示,PHEV感染N2a细胞后,miR-21a-5p的表达量明显升高。而有效抑制N2a细胞中miR-21a-5p的表达会使PHEV复制增殖显著下降;反之,miR-21a-5p过表达能使PHEV表达量升高。此外,生物信息学分析表明,miR-21a-5p可能在PHEV感染致病过程中参与了细胞免疫、神经损伤等过程。而预测靶基因Cntfr为CNTF受体,具有维持神经细胞形态和功能完整性的作用,并进一步利用双荧光素酶报告系统证实Cntfr为miR-21a-5p的靶基因。总之,miR-21a-5p在PHEV致病过程中具有极其重要的调控作用,影响PHEV的复制增殖,并具有直接靶向Cntfr基因维持神经细胞稳态的作用。研究结果不仅为miRNA参与调控PHEV复制提供数据支持,也为深入研究PHEV的致病机制提供新的思路。     

Ssc-miR-133a-5p的靶基因预测及其相关信号通路的生物信息学分析

课题组前期通过高通量测序技术发现,microRNAssc-miR-133a-5p在肥胖猪脂肪组织中表达水平显著下调,推测其可能在脂肪沉积过程中发挥了重要作用。分析ssc-miR-133a-5p序列保守性,利用TargetScan,miRDB和miRWalk在线分析工具预测其候选靶基因,进一步对候选靶基因进行蛋白质互作分析以及KEGG分析,最后将预测的靶基因与课题组前期筛选出的与猪脂肪沉积能力相关的基因取交集。结果表明ssc-miR-133a-5p候选靶基因PPARGC1A与RORA等,参与AMPK,TNF,与胰岛素分泌等信号通路。结果提示ssc-miR-133a-5p的候选靶基因可能通过多种信号通路发挥重要作用。文章的结果可为microRNA参与猪的脂肪生成调节机制提供科学依据。     

虹鳟酪氨酸酶基因的生物信息学分析及其在不同发育阶段和组织中的表达分析

酪氨酸酶（tyrosinase,Tyr）基因在调控动物色素合成的过程中发挥关键作用。为了解tyr基因与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）体色变异的关系,本研究对虹鳟tyr-1和tyr-2基因进行了蛋白序列分析,并利用实时荧光定量PCR检测两种基因在野生型虹鳟（虹鳟）和黄色突变型虹鳟（金鳟）体色发生的19个不同时期和成鱼13种不同组织中的表达差异。蛋白序列分析结果表明,Tyr-1和Tyr-2都是亲水性蛋白,且蛋白结构主要是无规则卷曲和α-螺旋;实时荧光定量PCR结果显示,tyr-1基因在胚胎各时期均有表达,tyr-1基因表达量在虹鳟受精期最高,桑椹期次之,且显著高于其他时期（P<0.05）;tyr-1基因表达量在金鳟16-细胞期最高,且显著高于其他时期（P<0.05）;tyr-2基因分别从虹鳟囊胚期和金鳟原肠期开始表达,表达量均在心跳期达到最高且显著高于其他时期（P<0.05）。出膜后,tyr-1、tyr-2基因分别在虹鳟5日龄和金鳟3月龄表达量最高。在胚胎各时期中,tyr-1、tyr-2基因在虹鳟中表达量普遍高于金鳟,出膜后普遍低于金鳟。在各组织中,tyr-1基因在皮肤、眼睛、肾脏、肝脏等组织中有较高表达,tyr-2基因主要在皮肤、眼睛中有较高表达,在其他组织中表达量较低。以上结果表明,tyr-1和tyr-2基因与虹鳟体色变异具有一定的相关性,为深入阐明虹鳟体色变异机制和体色遗传改良奠定了理论基础。     

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3C的原核表达及生物信息学分析

为获得猪脑心肌炎病毒（EMCV）3C蛋白并进一步了解其结构,本研究以EMCV HB10株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增3C基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定,挑选测序正确的质粒经双酶切获得目的片段并将其克隆至pET32a载体以构建重组原核表达质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌TranSetta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况,Western blotting检测纯化后3C蛋白及其对EMCV的反应原性。结果显示,成功克隆3C基因,长度为615 bp,编码205个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,3C蛋白主要以包涵体形式表达,His-3C蛋白大小约为40 ku。Western blotting分析可知,纯化后His-3C蛋白条带单一,同时3C蛋白与EMCV细胞毒有良好的反应原性。经生物分析软件预测可知,EMCV 3C蛋白为非分泌蛋白,无跨膜区,有多个磷酸化位点,参与蛋白的水解过程。3C蛋白酶作为EMCV基因组编码蛋白中唯一的蛋白酶,在病毒复制的过程中具有不可或缺的作用。本研究成功构建了EMCV 3C蛋白原核表达载体并对其结构进行了预测,为进一步研究3C蛋白的作用及催化机理奠定基础。     

Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of Nonstructure Protein 3C from Porcine Encephalomyocarditis Virus

To obtain the 3C protein of encephalomypcarditis virus (EMCV) and predict its structure,3C gene was amplified by RT-PCR with the RNA as template from HB10 strain. And the target gene inserted into pMD18-T vector. The plasmids were sequenced after verification by PCR and double enzyme digestion. The target gene was cleaved from the correct plasmid,and inserted into the pET32a vector. The recombinant pET32a-EMCV-3C was transformed into TranSetta (DE3) and then induced by IPTG. Then the size was identified by SDS-PAGE and the antigenicity was analyzed by Western blotting. According to the sequence results,the length of 3C gene was 615 bp,which encoded 205 amino acids. The results of SDS-PAGE showed that His-3C protein mainly existed in the form of inclusion body with the molecular of 40 ku. The Western blotting results verified that purified His-3C could react with rabbit anti-EMCV serum prepared with EMCV. Bioinformatics analysis indicated that 3C protein was non-secretory,and had multiple phosphorylation sites,but it had no transmembrane region. Thus,the 3C protein mainly involved in protein hydrolysis process.3C protease,as the only protease in the EMCV genome,played an indispensable role in viral replication. In this study,we successfully constructed the prokaryotic expression vector of 3C protein and predicted its structure,which provided a basis for further study of the role of 3C protein and catalytic mechanism.