酚酸影响红肉苹果花色苷辅色效果及稳定性

正据《中国农业科学》2017年第4期《酚酸对红肉苹果花色苷辅色效果及稳定性的影响》(作者苏帆等)报道,为研究酚酸对"紫红1号"新疆红肉苹果花色苷的辅色效应,以及辅色后花色苷的稳定性,为红肉苹果花色苷利用提供理论依据和参考。利用超声辅助法提取红肉苹果花     

新疆红肉苹果风味品质与抗氧化能力评价

<正>据《中国农业科学》2017年第8期《新疆红肉苹果3个品系的风味品质与抗氧化能力评价》(作者刘羽等)报道,为明确新疆红肉苹果风味物质组成与含量特征,了解其营养品质状况,为开发利用提供信息。分别采用高效液相色谱(HPLC)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术,以富士苹果"长富2号"为对照,检测分析3个新疆红肉苹果品系果皮和果肉的糖、酸和挥发     

三黄鸡CD154基因的克隆、序列分析与表达

CD154在抗原特异的T淋巴细胞和抗原提呈细胞的相互作用中发挥非常重要的作用。利用RT-PCR方法从三黄鸡的外周血单核细胞(PBMC)中克隆了鸡CD154基因全长cDNA,序列分析显示该基因cDNA全长819bp,可编码272个氨基酸。将克隆的鸡CD154全长cDNA克隆到原核表达载体pET-28a中获得表达质粒pET-28a-CD154,转化BL21(DE3)后未检测到特异性表达蛋白。进一步通过PCR获得去除信号肽(1~22 aa)和跨膜区(23~46 aa)的CD154基因片段(CD154d),并将其克隆到pQE80的6×His下游,在大肠杆菌中成功表达,获得分子量约27 ku的融合表达蛋白6×His-CD154d。Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。同时,将CD154基因全长cDNA插入真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游,获得真核表达质粒pEGFP-CD154,转染Hela细胞,荧光显微镜观察发现EGFP-CD154融合蛋白表达在细胞膜上,证实了鸡CD154的膜定位特性。本研究为进一步研究鸡CD154的结构与功能及其免疫佐剂效应奠定了基础。     

德州驴HO-1基因生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】克隆德州驴血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因,对其进行原核表达及多克隆抗体制备,同时检测HO-1基因在德州驴不同组织中的表达情况,为后期研究HO-1基因功能提供支撑材料。【方法】参考GenBank中公布的马HO-1基因序列(登录号：XM＿023631135.1)设计特异性引物,从驴原代肺泡巨噬细胞(donkey primary alveolar macrophages, DPAMs)中提取RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增HO-1基因编码区(coding sequences, CDS),对测序所获序列与其他物种进行相似性比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对HO-1基因编码蛋白进行生物信息学分析。将HO-1基因序列克隆至pCold-SUMO载体进行原核表达,经镍柱亲和层析纯化后,以重组的HO-1蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blotting检测多克隆抗体特异性及与抗原结合的最大稀释度。利用免疫组化试验检测德州驴4种组织中HO-1蛋白的表达水平。【结果】德州驴HO-1基因CDS区全长873 bp,编码...     

新孢子虫核糖体磷蛋白基因真核表达载体的构建及瞬时表达

采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。     

小尾寒羊CIB1基因全长cDNA克隆及原核表达

本研究旨在克隆小尾寒羊钙粘和蛋白1(Calcium and integrin binding protein 1,CIB1)基因cDNA全长,并在原核载体中表达.参照已发表的CIB1基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,采用RT-PCR法,从小尾寒羊睾丸组织中扩增获得CIB1基因全长cDNA.将其克隆到pMD19-T载体,并进行测序分析.将该基因编码区重组于融合表达质粒pET32a中,构建了重组原核表达载体(pET32a-CIB1).将其转化到BL21(DE3)pLysS宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.结果表明,克隆的CIB1基因cDNA与GenBank上登录的牛、猪、猕猴、人、小鼠、大鼠、黑猩猩等动物该基因序列的同源性达90%以上,编码氨基酸的同源性在93%以上,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为576 bp.实现了高效特异性融合表达,表达产物的分子质量约为38 ku.本研究结果为进一步研究CIB1蛋白功能打下良好的基础.     

鸡高迁移率族蛋白B1真核表达载体的构建及鉴定

为构建鸡高迁移率族蛋白B1(Chicken high mobility group B1 protein,chHMGB1)真核表达载体,并在真核细胞中进行暂态表达和鉴定。研究酶切回收含有鸡高迁移率族蛋白全长基因的PGEM-chHMGB1质粒,将chHMGB1全长与pcDNA3.1(+)载体连接构建pcDNA-chHMGB1全长重组表达质粒。将其质粒采用脂质体转染293T细胞,进行暂态表达,利用Western blotting和间接免疫荧光法对表达的蛋白进行鉴定。结果显示,pcDNA-chHMGB1重组表达质粒克隆片段大小正确,瞬时转染293T细胞,Western blotting在细胞浆和培养上清中同时检测到相对分子量约为30 ku的目的条带;利用chHMGB1特异性抗体进行IFA试验可以检测到目的蛋白的表达。本研究成功构建了鸡高迁移率族蛋白B1的真核表达载体pcDNA-chHMGB1,并且在真核细胞中得以有效表达,从而为进一步研究chHMGB1蛋白的生物学功能提供生物材料。     

鸡Mx基因的克隆与原核表达

本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白.利用poly Ⅰ:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测.表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku.说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础.     

苹果Mal d 1基因的原核表达及纯化

以“王林”苹果为试材,采用RT-PCR的方法克隆获得Mal d 1基因,并将该基因连接到原核表达载体pCold Ⅱ上,经测序确定所构建的重组载体pCold-Mal d 1开放阅读框正确。将获得的重组质粒pCold-Mal d 1转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经0.1 mmol?L-1IPTG,15 癈,24 h冷诱导表达,SDS-PAGE电泳检测,证明Mal d 1蛋白获得了稳定而高效的表达,所表达蛋白是大小约为22.4 kD的融合蛋白。经镍柱纯化后获得相对单一的蛋白,可用于免疫组织化学,蛋白印记检测等。     

荔枝AP1同源基因在花芽中表达最多

据《园艺学报》2011年第12期《荔枝APETALA1（AP1）同源基因cDNA全长克隆及其表达研究》（作者丁峰等）报道，应用RT—PCR方法克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全长，     

PADRE-TGFβ1融合蛋白的原核表达及鉴定

构建PADRE-TGFβ1原核表达质粒,并对其进行诱导表达和反应原性分析.对PADRE、联接序列(Linker)及TGFβ1的基因序列进行密码子优化,采用全基因合成的方法人工合成全长PADRE-Linker-TGFβ1序列,合成产物克隆至pET-28a(+)质粒.将构建好的质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受...     

新麦草细胞分裂素调控基因CKX4克隆及表达分析

分蘖数是影响新麦草饲草和种子产量的关键因素，其关键基因CKX4的克隆及表达分析可为新麦草产量的提高奠定基础。研究克隆了新麦草(Psathyrostachys juncea(Fisch.) Nevski)CKX4基因全长序列，对新麦草及其近缘物种的CKX4进行生物信息学分析；以多分蘖和少分蘖新麦草不同组织为材料，采用qRT-PCR及RNA-Seq方法研究CKX4的相对表达量；利用烟草瞬时转染和蛋白质印迹法分析CKX4-YFP的表达情况及CKX4蛋白的亚细胞定位。结果表明：克隆的新麦草CKX4基因全长为1 596 bp, 11个近缘物种的CKX4均有相同的结构域；系统发育树显示新麦草与小麦等麦类作物的亲缘关系最近；CKX4蛋白存在GHS组氨酸残基和Leu(亮氨酸)残基的功能位点；CKX4基因在少分蘖材料中表达量显著高于多分蘖材料；亚细胞定位显示CKX4定位于细胞内。新麦草CKX4蛋白在调控新麦草生长发育中起关键作用，本研究将为新麦草产量性状精准改良提供理论依据和参考。     

猪skMLCK基因全长cDNA测序及真核表达载体构建

为获得猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle myosin light chain kinase,skMLCK)基因全长cDNA序列,构建猪skMLCK基因的真核表达载体,参考GenBank预测信息并利用Primer Premier 5.0和DNAMAN生物学软件,分2段进行RT-PCR扩增,进行猪skMLCK基因的cDNA全长克隆、测序、拼接、合成,构建猪skMLCK基因的真核表达载体。结果获得了猪skMLCK基因的全长cDNA序列,序列长度为1 851 bp。成功构建了猪skMLCK基因的真核表达载体,重组质粒为pEGFP-N1-skMLCK。猪skMLCK基因全长cDNA的测序和真核表达载体的构建为进一步研究猪skMLCK基因在肌纤维生长发育中的作用奠定基础,为通过基因水平来改善与评价猪肉质性状提出了一个新方向。     

苹果可溶性糖组分及其含量特性的研究

<正>据《园艺学报》2015年第5期《苹果可溶性糖组分及其含量特性的研究》(作者郑丽静等)报道,以132个苹果品种为试材,采用离子色谱法对其成熟果实的可溶性糖组分进行测定,并测定其可溶性固形物含量(TSS)、可溶性糖含量(SS),利用频次分析、相关性分析、回归分析等统计分析方法,明确苹果果实可溶性糖     

小反刍兽疫病毒M蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗小反刍兽疫M蛋白多克隆抗体,提取小反刍兽疫病毒(PPRV,Nigeria 75/1疫苗株)总RNA,用RTPCR方法扩增M基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒进行酶切,回收目的片段后克隆于原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒PGEX-4T-1-M,转化大肠杆菌Transetta(DE3)并进行诱导表达,优化诱导蛋白表达条件,放大培养收获目的蛋白,并进行纯化,用纯化后的目的蛋白制备免疫原免疫昆明鼠制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。结果成功扩增出大小约为1 005bp(去掉终止密码子)的PPRV M基因;并构建了真核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体的形式表达,蛋白表达的最优条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导4h;用经Ni-NTA纯化后的重组蛋白3次免疫昆明鼠后成功获得了PPRV M蛋白鼠源多克隆抗体,间接免疫荧光试验显示该多克隆抗体能够特异性识别非变性全长M蛋白。     

ICR小鼠Mxl基因的克隆及组织表达

为了对ICR小鼠的Mxl基因序列特征进行比较分析,揭示该基因的组织特异性表达规律,用干扰素诱导剂poly(I)/(C)诱导小鼠腹腔巨噬细胞,应用RT-PCR技术克隆小鼠Mxl基因全长编码区序列,并用半定量RT-PCR方法研究该基因在组织中的特异性表达规律.结果显示,从雌性ICR小鼠腹腔巨噬细胞中克隆的Mxl基因的CDS...     

番鸭白细胞介素2基因的克隆及其原核表达

为原核表达番鸭白细胞介素2 (MdIL-2),本研究利用ConA刺激诱导番鸭脾淋巴细胞,采用RT-PCR技术扩增MdIL-2基因的编码序列,并将其克隆至pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-MdIL-2,转化E.coli BL21受体菌.测序结果表明,MdIL-2基因ORF全长420 bp,编码140个氨基酸.重组菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白约为40 ku.Western blot分析表明,重组蛋白能够被抗GST单克隆抗体特异性识别.MdIL-2基因的克隆及其原核表达为进一步进行MdIL-2的活性检测以及应用研究奠定了基础.     

香蕉茉莉酸合成关键酶基因MaOPR被体外成功克隆和表达

据《园艺学报》2013年第3期《香蕉茉莉酸合成关键酶基因MaOPR的克隆和表达分析》(作者许奕等)报道,从"巴西"香蕉(Musa acuminata L.AAA group’Brazilian’)根的cDNA文库中获得了一段12-氧-植物二烯酸还原酶OPR(12-oxo-phytodienoic acid reductase)基因的片段,RACE扩增获得全长,     

奶牛NR1D1基因的真核表达载体构建、表达谱及其在卵巢组织的定位

旨在克隆奶牛核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)基因的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),构建其真核表达载体，预测分析NR1D1基因的生物学功能，并检测该基因的组织表达谱及其在卵巢组织的表达分布。本研究以5头健康的24月龄雌性奶牛为试验动物，PCR扩增带有同源臂的奶牛NR1D1基因CDS区全长片段，利用同源重组法将目的片段连接至线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA空载体，构建重组质粒，利用酶切、PCR及测序对重组质粒进行鉴定。结合质粒测序结果，利用生物信息学软件预测分析该基因的生物学功能。将鉴定正确的质粒转染至HEK293T细胞，利用实时荧光定量PCR(qPCR)与Western blotting技术检测NR1D1基因在mRNA与蛋白水平的表达。此外，利用qPCR检测奶牛NR1D1基因的组织表达谱，并利用免疫组织化学技术检测NR1D1蛋白在奶牛卵巢组织的表达分布。结果，成功获得带有同源臂的奶牛NR1D1基因的CDS区全长片段(1 884 bp),酶切、PCR及...     

柔嫩艾美耳球虫子孢子高表达新基因的克隆、表达及分析

为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。