斑节对虾钙网蛋白基因cDNA克隆和表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。     

斑节对虾cyclin H基因的原核表达和蛋白纯化

cyclin H是细胞分裂周期调控中的重要因子,研究斑节对虾cyclin H对阐明斑节对虾卵巢发育机制有重要意义。构建了斑节对虾cyclin H的重组表达质粒p ET21a/cyclin H,利用原核表达技术进行诱导表达获得目的蛋白,并用亲和层析技术进行纯化,用SDS-PAGE、Western blot和质谱联用分析诱导和纯化结果。结果表明,斑节对虾cyclin H重组蛋白获得了表达,纯化的蛋白经鉴定为cyclin H重组蛋白;在22℃和37℃培养条件下,重组蛋白在LA和YTGA两种培养基上均能被诱导表达;22℃条件下,部分融合蛋白为可溶性表达;在37℃培养条件下LA培养基获得较好的效果,且均以包涵体形式存在。     

斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

根据本实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon)c DNA文库得到的EST序列,利用RACE技术获得了斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因(Pm GS)的c DNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量的方法研究了Pm GS基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 420bp,开放阅读框(ORF)为1 086 bp,3'非编码区(UTR)为294 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为40 bp。ORF可编码361个氨基酸,预测分子量为40.423 ku,理论等电点为6.19。序列含有一个谷氨酰胺结合结构域(Gln-synt_C),8个磷酸化位点,2个糖基化位点。斑节对虾和中国明对虾的GS基因的相似性最高,达99%。Pm GS-mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在淋巴组织中表达量最高,其次为鳃组织,在胸神经中的表达量最低。96 h高浓度氨氮胁迫后,Pm GS-mRNA在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组,但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P0.05)。以上结果暗示,Pm GS在氨氮代谢方面具有重要的作用,可能参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

牡丹泛素延伸蛋白基因片段克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从牡丹(Paeonia suffruticosa)花瓣中克隆得到泛素延伸蛋白基因的cDNA片段,该片段长423bp,编码140个氨基酸残基,命名为PsUBQ,GenBank登录号为JN699053。PsUBQ编码的蛋白是在泛素单体后融合了1个核糖体S27a多肽,经多重序列比对发现该蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜樱桃(Prunus avium)、葡萄(Vitis vinifera)等高等植物泛素延伸蛋白的氨基酸序列具有很高的一致性。实时荧光定量PCR分析表明:PsUBQ在牡丹不同组织间表达较稳定,且在切花开放各级别花瓣中呈组成型表达。PsUBQ的克隆与表达为进一步探讨牡丹开放衰老进程中泛素对激素信号的作用机制打下基础,同时为研究牡丹目标基因的表达提供校正标准。     

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional genomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment search tool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基).该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构.与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性.     

斑节对虾MKK4基因的表达分析

从斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组织cDNA文库中筛选并获得了斑节对虾MKK4基因的cDNA片段,然后采用荧光定量的方法研究了MKK4基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明,MKK4的mRNA在各组织中都有表达,其中在未成熟精巢中表达量最高,其次分别为雌、雄个体的肠。在精巢不同发育阶段,其在未成熟精巢的表达量极显著高于成熟精巢。对卵巢不同发育期的研究表明,从Ⅱ期开始,随着卵巢的发育,MKK4mRNA的表达量逐渐增加,到第Ⅵ期时表达量达到最高。而在Ⅰ期的表达量虽高于Ⅱ期和Ⅲ期、低于Ⅳ期,但其与其他3期均无显著差异。     

斑节对虾1种lectin基因的电子克隆及分析

以中国明对虾的c-lectin(DQ167572)基因为探针,搜索EST数据库,获得了日本对虾的1个lectin序列,通过电子克隆扩增到了该基因,并对基因进行了生物信息学分析.     

斑节对虾腺苷酸转移酶(PmANT)基因的cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3’非编码区(UTR)为393 bp,5’非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在各组织中都有表达,其中,在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。     

斑节对虾cdc25基因的表达分析

在已构建的斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组cDNA文库中筛选了cdc25基因的EST序列,使用实时荧光定量PCR获得了cdc25基因在雌性个体不同组织及卵巢不同发育阶段的表达情况。结果表明:cdc25基因在雌性个体的卵巢、淋巴、脑神经、血、肌肉、心脏、鳃、肝胰腺和肠9种组织中均有表达,并存在显著性差异,其中心脏的相对表达量最高。同时,cdc25基因在卵巢发育6个时期的时序表达结果显示,cdc25基因在卵巢中的相对表达量在Ⅰ期最大,与其他5期存在显著差异,而后骤降,直到Ⅴ期才稍微升高,随后又逐渐降低。     

斑节对虾PmML1和PmML2基因的鉴定及表达分析

为进一步了解ML家族基因在斑节对虾先天免疫中的作用,采用PCR和RACE方法克隆到斑节对虾(Penaeus monodon)2个ML家族基因PmML1和PmML2,并对其进行生物信息学分析,同时通过实时荧光定量PCR技术分析2个ML家族基因在斑节对虾各组织的表达分布。结果显示：PmML1的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为462 bp,编码153个氨基酸;PmML2的ORF为471 bp,编码156个氨基酸。2个基因都具有1个典型的ML家族蛋白结构域。多重比对结果显示,2个基因的ML结构域与组成3对二硫键的半胱氨酸残基位置都相对保守。氨基酸序列对比结果显示,PmML1和PmML2之间的相似性仅为42.37%。PmML1与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的ML蛋白MjML4的相似性最高,比例高达91.5%,PmML2与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的ML蛋白相似性最高,比例高达88.46%。系统进化分析结果显示,PmML1和PmML2存在于2个不同的分支,说明2个基因的进化相对独立,证明本研究中鉴定到的是2个不...     

斑节对虾鳃Na~ /K~ -ATPase的活性

研究了培养介质的Na 、K 和Mg2 浓度、Na ∶K 比、pH值、培养温度以及培养时间和底物ATP -Na2量对斑节对虾鳃Na /K ATPase活性的影响。培养介质中Na 浓度为 5 0～ 10 0mM、K 浓度为 2 5～ 30mM、Mg2 浓度为 8～ 2 0mM、Na ∶K 比在 10∶1～ 2∶1、pH 7.0～ 7.5时 ,Na /K ATPase活性较高 ,Na /K ATPase活性随着培养温度升高而增大。Na /K ATPase反应时释放出的无机磷 (Pi)累积量与培养时间呈直线性增加。底物ATP Na2 浓度达到 1.0 4mM时 ,Na /K ATPase活性达到最高 ,随着ATP Na2 量的增多 ,Na /K ATPase活性并未增大     

斑节对虾鳃Na~ /K~ -ATPase的活性

研究了培养介质的Na 、K 和Mg2 浓度、Na ∶K 比、pH值、培养温度以及培养时间和底物ATP -Na2量对斑节对虾鳃Na /K ATPase活性的影响。培养介质中Na 浓度为 5 0～ 10 0mM、K 浓度为 2 5～ 30mM、Mg2 浓度为 8～ 2 0mM、Na ∶K 比在 10∶1～ 2∶1、pH 7.0～ 7.5时 ,Na /K ATPase活性较高 ,Na /K ATPase活性随着培养温度升高而增大。Na /K ATPase反应时释放出的无机磷 (Pi)累积量与培养时间呈直线性增加。底物ATP Na2 浓度达到 1.0 4mM时 ,Na /K ATPase活性达到最高 ,随着ATP Na2 量的增多 ,Na /K ATPase活性并未增大     

斑节对虾鳃Na^＋／K^＋—ATPase的活性

研究了培养介质的Na^ 、K^ 和Mg^2 浓度、Na^ ：K^ 比、pH值，培养温度以及培养时间和底物ATP-Na2量对斑节对虾 锶Na^ /K^ -ATPase活性的影响，培养介质中Na^ 浓度为50-100mM、K^ 浓度为25-30mM、Mg^2 浓度为8-20mM、Na^ :K^ 比在10：1-2：1、pH7.0-7.5时，Na^ /K^ -ATPase活性较高，Na^ /K^ -ATPase活性随着培养温度升高而增大，Na^ /K^ -ATPase反应时释放出的无机磷（Pi)累积量与培养时间呈直线性增加，底物ATP-Na2浓度达到1.04mM时，Na^ /K^ -ATPase反应时释放出的无机磷（Pi)累积量与培养时间呈超级一性增加，底物ATP-Na2浓度达到1.04mM时，Na^ /K^ -ATPase活性达到最高，随着ATP-Na2量的增多，Na^ /K^ -ATPase活性并未增大。     

斑节对虾UBE2H基因克隆及其表达

【目的】克隆斑节对虾(Penaeusmonodon)泛素结合酶E2 H基因(UBE2H),了解其组织特异性表达情况,为揭示UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程的作用提供依据。【方法】PCR扩增斑节对虾UBE2H基因的开放阅读框,利用实时荧光定量PCR检测UBE2H基因在斑节对虾各组织及不同发育期斑节对虾肝胰腺和卵巢中的表达情况;并构建pET32a-UBE2H原核表达重组质粒,进行诱导表达及蛋白纯化。【结果】克隆获得的斑节对虾UBE2H基因全长1010 bp (GenBank登录号KU870456),其中,5'非编码区77 bp,3'非编码区378 bp,开放阅读框555 bp(编码184个氨基酸)。斑节对虾UBE2H蛋白等电点(pI)4.88,分子量20.85 kD。斑节对虾UBE2H氨基酸序列与其他物种相似度很高,为78.00%~83.00%。实时荧光定量PCR检测结果显示,UBE2H基因在斑节对虾淋巴组织中表达量最高,其次为鳃;在斑节对虾不同卵巢发育期肝胰腺和卵巢中的表达量均呈先上升后下降的变化趋势,但其峰值出现时间存在差异,肝胰腺的最高表达量出现在卵巢III期,卵巢的最高表达量出现在卵巢II期。经原核表达获得的斑节对虾UBE2H融合蛋白约39.00 kD,纯化后的蛋白浓度为2.92μg/μL。【结论】斑节对虾UBE2H参与了其卵母细胞发育和肝胰腺中卵黄蛋白的转运过程,与斑节对虾的卵巢发育密切相关。     

异育银鲫PTX3基因的克隆与表达分析

为研究Pentraxin 3(PTX3)在鱼类中的作用,克隆得到异育银鲫(Carassius auratus gibelio)PTX3基因,并对其序列结构特征和表达模式进行分析。异育银鲫PTX3序列由3个外显子和2个内含子构成,编码453个氨基酸。异育银鲫PTX3蛋白的前22aa为信号肽,241~453aa为PTX结构域;在PTX结构域有一个非典型的Pentraxin信号。同源进化分析发现,异育银鲫PTX3与其他鱼类聚为一支,且与斑马鱼最为相似(79%);两栖类和哺乳类各自聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,PTX3在异育银鲫的心脏、肝脏、脾脏、头肾、体肾、鳃、脑、肌肉、肠、血液、性腺等11个组织中都有表达。在嗜水气单胞菌攻毒后,肝脏、脾脏、头肾、肠和血液中PTX3mRNA水平都显著上调。在感染后3h,脾脏中PTX3 mRNA水平即出现显著上调;感染后6h,血液中PTX3mRNA水平即达到了峰值。这些结果表明,PTX3作为急相反应蛋白在鱼类受到病原侵袭中发挥免疫保护作用。     

鸭TTR基因cDNA克隆和表达研究

为研究转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)与肉鸭脂肪代谢的相关性,通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)获得北京鸭TTR基因全长cDNA序列,并采用实时荧光定量PCR法对鸭TTR基因表达谱进行研究。结果显示:鸭全长TTRmRNA编码150个氨基酸的前体肽,该肽含20个氨基酸的信号肽和130个氨基酸的成熟肽;与哺乳动物相比,鸭TTR亚基N-末端序列多出的3个氨基酸Val-Ser-His,可能使鸭TTR结合甲状腺素T3的亲合力增加。定量检测结果表明,鸭TTRmRNA在脉络丛中的表达量最高,与鸡、爬行类和哺乳动物类似。本实验证实鸭TTR基因在脉络丛中的表达量比鸡更高,并首次发现TTRmRNA在鸭皮下脂肪组织中表达。     

斑节对虾卤淡水封闭养殖技术

从池塘选址、水质处理、苗种选择、投喂管理、日常观测及管理、防治病害、收获等方面阐述了斑节对虾的养殖,并且通过对斑节对虾的试养,认为该品种适合本地区养殖,可大力开发推广。