牛产气荚膜梭菌分离株毒素基因的检测与分析

为了解黑龙江省牛源产气荚膜梭菌分离株的基因型,检测β2和CPE两种次要毒素因子在牛源产气荚膜梭菌分离株中的携带情况。通过PCR方法检测了产气荚膜梭菌13个野毒株的cpa、cpb、etx、itx四种分型毒素、cpb2、cpb2的两个等位基因突变体(atypical cpb2和consensus cpb2)及肠毒素(cpe)基因。结果表明:92.3%(12/13)的产气荚膜梭菌分离株为A型,检测到1株D型;A型菌中β2毒素基因检出率为66.7%(8/12);β2毒素基因阳性菌株中75%(6/8)携带非典型cpb2基因,50%(4/8)携带典型cpb2基因,非典型突变体占优势。动物致病性试验发现β2毒素阳性菌株(8株)与β2毒素基因阴性菌株(4株)各有2株分离株具有致病性。所有菌株CPE毒素基因PCR检测均为阴性。研究为产气荚膜梭菌病的发病机理和疫苗开发提供了理论依据。     

产气荚膜梭菌毒素型菌落多重PCR方法的建立及应用

根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因cpa、cpb、etx、iA设计并合成4对特异性引物,建立快速鉴定产气荚膜梭菌毒素型的多重PCR方法。结果显示:产气荚膜梭菌A、B、C、D和E型参考菌株均扩增出相应的片段,而肉毒梭菌、气肿疽梭菌、腐败梭菌、诺维梭菌的扩增均为阴性;将产气荚膜菌株单个菌落稀释100倍,仍能扩增出相应的目的片段。利用此多重PCR方法对16株不同动物来源的产气荚膜梭菌进行分型鉴定,并与毒素中和试验鉴定结果进行比较,结果显示2种方法具有较高的符合率。该方法可有效进行产气荚膜梭菌的快速检测和分型,对产气荚膜梭菌感染与食品安全问题的研究具有参考价值。     

SDS-PAGE法检测产气荚膜梭菌毒素型研究

为了探索一种快速、准确检测产气荚膜梭菌毒素型的方法,以便有效预防控制该病的流行和发生,利用SDS-PAGE方法,对通过ELISA鉴定的20株(A型16株、C型3株和D型1株)德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株,以及通过Multiplex-PCR鉴定的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株外毒素蛋白的相对分子质量进行测定,以确定毒素的种类,进而确定菌株的毒素型。结果表明,产气荚膜梭菌标准株、德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株、山东省疫区产气荚膜梭菌分离株粗提外毒素的质量浓度分别为3.261,2.238~3.333,1.451~3.109mg/mL,精提外毒素的质量浓度分别为0.803,0.521~0.999,0.530~0.812 mg/mL。SDS-PAGE法检测的20株德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株中A型17株、C型2株、D型1株,与ELISA检测结果的符合率为95.0%;SDS-PAGE检测的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株全部是A型,与Multiplex-PCR检测结果的符合率为100%。说明应用SDS-PAGE方法对产气荚膜梭菌的检测结果与ELISA方法的检测结果有一定的差异性,与Multi-plex-PCR方法的检测结果一致。     

鸡源产气荚膜梭菌a毒素基因克隆表达及免疫原性的初步研究

从鸡源产气荚膜梭菌C57-86中PCR扩增出a毒素基因,构建了表达质粒p GEXKG-a,并进行核苷酸序列进化分析。结果表明,鸡源产气荚膜梭菌的a毒素基因与参考菌株strain AL08-16相似性较高,核苷酸同源性为97.7%。对重组菌株BL21/KG-a诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析,重组菌株BL21/KG-a可以高效地表达毒素蛋白质;免疫试验表明,表达产物免疫的SPF试验鸡可抵抗A型产气荚膜梭菌的攻击。     

兔流行性腹胀病样品中产气荚膜梭菌的分离鉴定

从发生典型病理特征的兔流行性腹胀病死亡兔盲肠内容物中分离到1株产气荚膜梭菌,命名为SD14-02。经革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA比对和毒素型特异性PCR等方法对分离细菌进行鉴定和分型,结果显示,分离株SD14-02为革兰氏阳性杆菌,生化鉴定显示其符合产气荚膜梭菌的生化图谱。经系统发育分析,SD14-02的16S rRNA基因序列与产气荚膜梭菌位于同一分支。经毒素型特异性PCR方法鉴定,SD14-02为A型产气荚膜梭菌,蛋白电泳显示其与A型产气荚膜梭菌疫苗株苏84-A存在一定差异。动物试验证明SD14-02对小鼠具有致病性。研究结果为兔流行性腹胀病致病原的进一步研究奠定了基础。     

零售肉品中产气荚膜梭菌的检测与定型：以陕西关中地区为例

【目的】检测陕西关中地区肉品中的产气荚膜梭菌,并进行血清型和产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)基因型鉴定,初步掌握该地区肉品中产气荚膜梭菌的污染状况。【方法】从陕西西安、杨凌、武功等地的超市、农贸市场、肉食品小摊随机采集新鲜生熟鸡、猪肉及其制品,共计314份,经细菌分离纯化、染色镜检、生化试验和单重PCR检测确定分离菌株为产气荚膜梭菌,应用多重PCR检测分离菌株的血清型并进行cpe毒素基因检测。【结果】样品中产气荚膜梭菌检出率为45.86%,且均为A型cpe产气荚膜梭菌,其中熟肉制品、生鲜肉检出率分别为50.91%和43.14%;鸡肉、猪肉检出率分别为53.06%和33.90%。【结论】陕西关中地区的肉品中存在产气荚膜梭菌污染,建议针对可能引起产气荚膜梭菌污染和大量繁殖的环节采取更有效的预防措施。     

江苏地区临床健康肉羊的产气荚膜梭菌感染分析

为揭示临床健康肉羊的产气荚膜梭菌感染概况,于2018年4-6月选择江苏地区肉羊养殖场30个,采集3～5月龄肉羊肛拭子样品892份.所有样品接种至梭菌增菌液,于厌氧条件下增菌培养后,以PCR进行产气荚膜梭菌的检测,并对部分检测为产气荚膜梭菌阳性的样品进行细菌分离.结果表明:175份(19.62％)肛拭子样品为产气荚膜梭菌阳性,提示临床健康肉羊的消化道可携带产气荚膜梭菌.数据分析表明,3、4、5月龄羊差异不显著,免疫羊与未免疫羊差异不显著.通过对分离的68株产气荚膜梭菌进行α、β、ε和ι毒素基因检测,确定了其中43株(63.24％)为A型产气荚膜梭菌,25株(36.76％)为D型产气荚膜梭菌,提示A、D型是江苏地区肉羊感染的主要产气荚膜梭菌类型.     

仔猪大肠杆菌·C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺

[目的]研究仔猪大肠杆菌、C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺。[方法]分别试验不同的培养时间、培养温度和接种剂量对大肠杆菌纤毛表达量和C型产气荚膜梭菌产生毒素的影响。[结果]大肠杆菌在接种剂量为3%～5%,在36～37℃条件下培养7 h,可产生较高含量的纤毛抗原;当接种剂量为1%～2%,C型产气荚膜梭菌C59-2菌株在35℃条件下培养16～20 h,可产生大量致死性毒素。[结论]该研究为研制具有较好效果的仔猪红痢、黄痢预防疫苗提供了依据。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

羊源C型产气荚膜梭菌的分离鉴定、药敏试验及免疫治疗

从陕北某绵羊养殖场猝死绵羊的肝脏和脾脏中分离得到1株细菌,通过细菌培养特性、菌体形态、菌落特征、染色特性、生化试验、外毒素测定、毒素类型的PCR检测和药敏试验等鉴定,结果表明,该分离菌为革兰氏阳性大杆菌,生长特性和生化试验结果符合产气荚膜梭菌的所有特点;该菌可产生致小白鼠死亡的外毒素,PCR检测结果证实外毒素为α毒素和β毒素;药敏试验结果表明,该菌对环丙沙星、诺氟沙星等抗生素高度敏感,对庆大霉素、卡那霉素等抗生素不敏感。表明该菌为引起绵羊猝狙的C型产气荚膜梭菌,用羊梭菌疫苗紧急免疫羊群并配合应用抗生素治疗能有效控制该病的流行。