奶牛乳腺上皮细胞体外培养条件优化的初步研究

从培养基、细胞接种浓度、冻存液三方面对奶牛乳腺上皮细胞体外培养条件进行了优化。采用台盼兰染色计数方法绘制细胞生长曲线,评定细胞体外生长增殖。结果表明,使用DMEM/F12培养基细胞生长状况最好,DMEM培养的细胞较DMEM/F12生长缓慢,F12其次,RPMI1640培养细胞生长最慢;以1×104的接种浓度于24孔板,细胞生长状态最好,细胞的生长周期经历了潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期4个生长阶段,生长曲线符合"S"型生长规律;采用胎牛血清(90%FBS+10%DMSO)和培养基(70%培养基+20%FBS+10%DMSO)两种冻存液冻存奶牛乳腺上皮细胞,细胞复苏培养后,胎牛血清冻存的细胞生长状态和增殖速度都明显优于培养基冻存的奶牛乳腺上皮细胞,从培养的第3天开始,2组细胞数量差异显著(P0.05)。本研究结果为建立体外培养体系提供了一定参考。     

灵芝菌丝体活性三萜抗肿瘤活性的研究

探讨活性灵芝三萜对各种癌细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。采用MTT观察活性三萜对癌细胞的生长抑制作用,采用共聚焦扫描电镜和流式细胞术检测了该活性三萜对各种癌细胞的促凋亡作用。该活性灵芝三萜能够剂量依赖性地抑制各种癌细胞的增殖,并且在流式细胞术检测出现亚二倍体峰,共聚焦扫描电镜可观察到凋亡细胞。该活性灵芝三萜能够抑制各种癌细胞的生长并能诱导细胞发生凋亡。     

硒化牡蛎多糖制备及其抗氧化和抗肿瘤活性研究

亚硒酸钠和牡蛎多糖合成硒化牡蛎多糖(SeOPS),纤维素DE-52分离纯化,红外光谱结构表征。DPPH·,ABTS+和·OH清除作用及铁还原力测定SeOPS抗氧化活性。MTT法检测SeOPS抑制肿瘤细胞增殖能力,采用流式细胞术检测SeOPS对细胞周期和凋亡的影响。结果表明,SeOPS具有清除DPPH·和ABTS+作用,IC50值分别为7.102 mg/m L和2.243 mg/m L。·OH及铁还原力清除效果与牡蛎多糖(OPS)无显著差别。SeOPS阻滞人宫颈癌(Hela)细胞G0/G1期及肝癌(HepG2) S期的发育,诱导细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞的增殖。     

麝鼠香囊腺形态学观察及腺上皮体外培养初报

取泌香期成年麝鼠香囊腺或对非泌香期麝鼠进行人工诱导香腺发育后取材,在形态学观察的基础上,分离香囊腺上皮细胞并进行体外初步培养。结果显示,用1mg/ml Ⅳ型胶原酶和0.25mg/ml胰蛋白酶分次于37℃下消化组织块5h和15min,可得到大量的分散单细胞用于原代培养;用含10%胎牛血清和双抗的DME/F12培养液为基础液,在培养液中添加10ng/ml表皮生长因子(EGF),对麝鼠香囊腺上皮细胞的存活和生长具有较明显的促进作用;腺上皮细胞可进行传代培养,也可用常规方法进行冷冻保存和复苏;体外传代培养到第5代的上皮细胞仍增殖旺盛,细胞内有丰富的脂滴,细胞分泌活动旺盛。提示,通过体外分离培养麝鼠香囊腺上皮细胞,建立香囊腺干(前体)细胞系,进而用细胞工程方法大量生产人工麝鼠香是可能的。     

PGE2可以恢复缺少内源性PGs的牛体外早期胚胎的正常发育

旨在研究外源添加PGE2(前列腺素E2)对缺少内源性前列腺素(PGs,Prostaglandins)的牛IVF早期胚胎外发育的影响。在牛IVF胚胎中抑制内源前列腺素合成再外源添加PGE2,以观察PGE2对牛IVF胚胎发育的作用以及起作用的胚胎阶段。并检测PGE2受体的mRNA水平。抑制胚胎内源性前列腺素合成限速酶COX-1和COX-2会使牛IVF胚胎卵裂率、8-16细胞率、囊胚率以及孵化率显著低于常规培养组;而外源添加PGE2能够补偿IVF胚胎因缺少内源性PGs导致的损伤,基本抵消COX-1和COX-2的特异性抑制剂对牛早期胚胎体外发育产生的不利影响;PGE2的添加浓度以1×10-8mol/L为宜,并且其补偿作用发生在8细胞阶段之前。利用半定量RT-PCR未能检测到以上6个阶段IVF胚胎上EP1、EP2、EP3和EP4四种受体的mRNA。PGE2可以恢复缺少内源性PG的牛体外IVF早期胚胎的正常发育。     

睾丸提取液、EGF、雌激素对小鼠精原干细胞 体外存活和增殖的效果

为探讨成年小鼠睾丸提取液（testicular abstract, TA）、表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、雌二醇-17β(estradiol-17β, E2)对小鼠精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）体外存活及增殖的作用。用胶原酶-胰蛋白酶消化、差速贴壁法分离8 d小鼠的SSCs，培养于STO细胞饲养层上，培养液中分别添加不同浓度的TA、EGF和E2，观察SSCs的存活时间和增殖能力。结果显示，添加3种因子后，SSCs的平均存活时间与对照组相比虽无显著差异。但在20~40 ng/ml EGF和10~100 pg/ml E2组中SSCs的平均存活时间均明显延长，且在较长时间段内观察到了处于明显增殖期的细胞。提示20~40 ng/ml EGF和10~100 pg/ml E2对小鼠SSCs的体外存活和增殖具有一定良好作用。     

绣球菌多糖诱导K562、THP-1细胞凋亡的研究

本文的目的是研究绣球菌多糖对K562、THP-1细胞凋亡的诱导作用。利用MTT比色法测定绣球菌多糖对K562、THP-1细胞增殖的抑制作用;通过吖啶橙染色观察K562、THP-1细胞形态学上的改变;同时利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的情况。实验结果表明：经绣球菌多糖处理后,K562、THP-1细胞的生长受到了显著抑制,最大抑制率分别为46.57%和59.82%;K562、THP-1细胞出现了典型的细胞凋亡形态学特征;同时,琼脂糖凝胶电泳呈现DNA梯形条带。由此说明,绣球菌多糖可在体外抑制K562、THP-1细胞生长并诱导其凋亡。     

不同因素对牛IVF胚胎体外发育影响的研究

为进一步完善牛胚胎体外发育体系,以体外受精胚胎为研究对象,对精子获能液、胚胎培养液、血清与BSA添加浓度、卵丘细胞共培养等影响体外胚胎发育体系的各个因素进行筛选优化。结果表明,BO获能液比普通获能液能够获得更高的卵裂率;添加葡萄糖、BSA以及不同浓度血清的牛胚胎培养液比未添加组有更好的发育效果,卵裂率、囊胚率分别达到(79.85±0.74)%、(28.69±1.45)%;在此基础上,牛卵丘细胞与牛胚胎共培养可将囊胚率进一步提高至(32.70±1.73)%,并用免疫荧光染色验证其卵丘细胞未发生凋亡。本研究进一步优化了牛胚胎体外发育体系,提高了体外胚胎的囊胚发育率。     

山羊松果体细胞原代培养及其生物学特性研究

目的：观察体外培养山羊松果体细胞的增殖情况和功能状态,为进一步提高季节性繁殖动物的繁殖率提供理论基础。方法：对松果体细胞进行培养,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,5-HT免疫组织化学染色显示细胞的功能状态。结果：松果体细胞呈圆形或多角形,折光性强,细胞体积有增大趋势;细胞有明显的增殖现象,大约于11d达到高峰;5-HT阳性细胞数量随细胞的增殖而增加。结论：山羊松果体细胞在体外增殖旺盛。     

白芨外泌体的分离及对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的凋亡保护研究

探索鲜白芨(Bletilla striata)外泌体对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的生物活性,为其在护肤品上的开发提供数据。聚乙二醇(PEG)沉淀法提取白芨外泌体,透射电镜鉴定,BCA法测蛋白浓度;细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK8)法检测Hacat细胞存活率,流式双染检测凋亡,蛋白印迹法检测凋亡相关通路蛋白。白芨外泌体呈茶杯状具双层膜,平均粒径69.63 nm,每克鲜白芨含外泌体浓度为5.24E+8 Particles,内含蛋白19.53μg;白芨外泌体(≥5μg/mL)可显著提高体外Hacat细胞存活率(P<0.05);10μg/mL白芨外泌体处理48h,可显著降低H₂O₂氧化造模引起的Hacat细胞早凋亡、晚凋亡和总凋亡的细胞比例(P<0.01),同时,模型组caspase-9和caspase-3表达显著上升,外泌体处理能显著降低其表达,而Bcl-2表达在组间无差异(P<0.05)。PEG沉淀法分离的白芨外泌体,可促进体外Hacat生长,抑制H2O2引起的细胞凋亡且与蛋白caspa...     

乳酸抑制肿瘤坏死因子α诱导的仔猪空肠上皮细胞凋亡初探

为探讨乳酸菌主要代谢产物乳酸抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的仔猪空肠上皮细胞凋亡的作用以及保护肠黏膜屏障的部分机制,分别使用TNF-α(200μg/L)、乳酸(100μL/L)、TNF-α(200μg/L)+乳酸(100μL/L)处理仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)组,并设空白对照。用MTT法检测各组的细胞活力;用ELISA方法检测各组caspase-3的蛋白表达量和蛋白活性。结果表明：TNF-α组的细胞存活率极显著低于对照组(P＜0.01),乳酸+TNF-α组可显著升高细胞存活率(P＜0.05)。乳酸+TNF-α组caspase-3蛋白量和活性显著低于TNF-α组(P＜0.05)。乳酸可以抑制TNF-α诱导的IPEC-J2细胞损伤,抑制TNF-α诱导的caspase-3蛋白表达量和蛋白活性的升高,提示乳酸菌主要代谢产物乳酸可通过抑制上皮细胞凋亡来保护肠上皮细胞,进而保护肠黏膜屏障。     

黄芩苷抗热应激小鼠输卵管氧化损伤的研究

为降低热应激引起的动物机体活性氧(ROS)增加,减少组织氧化损伤和细胞过度凋亡。利用小鼠模型研究热应激对输卵管组织和细胞的损伤作用以及黄芩苷(Bai)对损伤的保护作用。将小鼠分为对照(Ⅰ)组;Bai(Ⅱ)组;热应激(Ⅲ)组和热应激加Bai(Ⅳ)组。用试剂盒检测组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活力;用Western Blot检测Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、苯醌氧化还原酶(NQO1)和血红素氧合酶-l(HO-1)蛋白表达;用免疫组化方法检测凋亡因子Apaf-1和Caspase-9蛋白表达。结果显示,与对照组相比热应激后小鼠输卵管组织MDA含量显著增加(P0.05),CAT和GSH-Px活力显著降低;同时,Nrf2、Keap1蛋白表达量显著升高(P0.05),凋亡因子Apaf-1和Caspase-9蛋白表达明显增加。注射黄芩苷后可显著(P0.05)降低小鼠输卵管组织MDA含量和Nrf2和Keap1蛋白表达量,降低凋亡因子Apaf-1和Caspase-9蛋白表达,并且显著增加(P0.05)SOD、CAT和GSH-Px活力。结果表明,黄芩苷能降低热应激小鼠输卵管组织的氧化损伤和细胞凋亡,其机制可能与激活抗氧化信号通路Keap1-Nrf2/ARE有关。     

SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响

通过研究转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)的特异性小分子拮抗剂SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响,探讨转化生长因子β在鹿茸快速生长中的调节机制。分离培养生长30天的梅花鹿鹿茸软骨层细胞,将传代培养第2代的细胞经不同浓度的SB-431542 (0,1,3,5,8,10μM)作用,培养48小时后用MTT法测其细胞增殖的变化,并用SPSS软件分析其差异性。结果显示,SB-431542处理组细胞增殖活性都低于对照组(P＜0.05),其中浓度为8μM和10μM的SB-431542处理组与对照组相比差异非常显著(P＜0.01),随着添加SB-431542浓度的升高,对细胞的生长速度抑制更加明显,试验表明,TGF-β对维持梅花鹿鹿茸软骨层细胞的快速增殖有重要作用。     

玉米种子萌发期根缘细胞对 NaCl 胁迫响应

NaCl胁迫是导致玉米盐害的主要因素,研究了NaCl对玉米萌发期根系和离体根缘细胞的影响。结果表明,随着NaCl浓度从0 mmol/L增加到250 mmol/L,胚根长和次生根数量受到显著抑制,同时根缘细胞存活率也显著降低。但在100 mmol/L的NaCl胁迫下,根缘细胞的数量比对照和高浓度胁迫有显著增加,同时100 mmol/L的NaCl胁迫也显著刺激了玉米离体根缘细胞的凋亡速度。由于试验材料对100 mmol/L的NaCl胁迫有一定耐性,因此,认为该胁迫浓度下根缘细胞数量增加可能与其耐盐性有关,为进一步探讨根缘细胞与玉米耐盐机制的关系奠定了基础。     

牛子宫内膜上皮细胞的体外培养及鉴定

旨在改良牛子宫内膜细胞原代培养方法,并鉴定其特征。分别比较了单纯组织块培养法和先组织块培养后再消化纯化的方法对牛子宫内膜细胞进行培养以及纯化。经免疫荧光染色方法对两种方法获得的牛子宫内膜上皮细胞进行角蛋白表达鉴定。研究结果表明：先组织块培养后再消化纯化的方法获得的牛子宫内膜上皮细胞形态良好,纯度较高。因此,组织块培养后再消化纯化得到的牛子宫内膜上皮细胞是一种操作简单、高效的方法,用该方法得到的细胞可以在体外传至4~5 代,此结果为牛繁殖生理及其机制模型的建立奠定基础。     

马尾藻岩藻聚糖硫酸酯抑制HepG2细胞的增殖研究

采用MTT方法考查不同浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2细胞存活率的影响,进一步运用流式细胞仪和检测ROS含量探讨马尾藻岩藻聚糖硫酸酯抑制HepG2细胞增殖的机理。结果表明,在0.5~8.0 mg/mL内,HepG2细胞的存活率随着马尾藻岩藻聚糖硫酸脂浓度的升高呈下降趋势。研究发现,随着马尾藻岩藻聚糖硫酸脂浓度的增加,细胞内SubG1和G0/G1的细胞数量升高。而且,通过检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量,发现随着马尾藻岩藻聚糖硫酸脂浓度的增加,细胞内ROS含量显著升高。马尾藻岩藻聚糖硫酸脂抑制HepG2细胞增殖是通过诱导细胞内ROS的过量产生导致细胞发生凋亡和G0/G1阻滞。     

c9,t11-CLA对人结肠癌细胞(Caco-2)的抑制作用

采用体外细胞培养方法,通过MTT实验,研究了c9,t11-CLA(Conjugated Linoleic acid,CLA)在不同浓度,(0,25,50,100,200μmol/L)、不同作用时间(1,2,3,4 d)下,对人结肠癌细胞Caco-2增殖的影响。结果表明,c9,t11-CLA抑制了Caco-2细胞的增殖,且对Caco-2细胞增殖的抑制作用与浓度和作用时间密切相关。     

金银花、山银花绿原酸类提取物体外抗NDV作用研究

为研究比较价格差异较大的金银花和山银花的体外抗病毒作用,分别提取金银花和山银花绿原酸类活性成分,利用Vero细胞体外培养系统,通过观察细胞病变效应（CPE）,并用MTT法检测细胞活性来评价和比较金银花和山银花绿原酸类提取物体外抑制新城疫病毒（NDV）对细胞的感染作用。结果表明：在安全浓度范围内,金银花和山银花绿原酸类提取物均具有显著的抗病毒作用,体外对NDV分别具有明显的阻断作用、抑制作用和中和作用,且两者之间的抗病毒效果差异不显著。本试验为价格相对便宜的山银花在一定领域部分代替金银花提供了实验依据。     

表皮生长因子的作用机理及对体外受精的影响

表皮生长因子(EGF)是一种重要的多肽类生长因子,它对卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育具有明显的促进作用。大量研究表明:EGF能够以旁分泌(Paracrine)或自分泌(Autocrine)的形式作用于胚胎组织中的EGFR,刺激内细胞团(ICM)和滋养外胚层的增殖,从而调节早期胚胎的发育。     

激素对牛卵母细胞体外成熟的影响

研究了促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)和17 β雌二醇(17β-E2)分别使用时对牛卵母细胞体外成熟的作用.结果表明,这三种激素单独使用时,都具有促进牛卵母细胞体外成熟的能力.在低浓度范围内,随着激素浓度的上升成熟率也上升,FSH和LH在50μg/mL,17β-E2在20μg/mL浓度时达到最好成熟效果.