抗猪传染性胃肠炎病毒重组S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA方法进行筛选和有限稀释法3次克隆,获得2株稳定分泌抗TGEV重组S蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为C7C882和B5G8G7,其染色体平均计数均为88±10对,制备腹水抗体效价分别为1:2×105和1:104,分泌抗体亚类均为IgM型.2株杂交瘤细胞上清与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪伪狂犬病病毒(PrV)均无交叉反应,与TGEV感染细胞经间接免疫荧光检测均呈黄绿色荧光.     

抗猪传染性胃肠炎病毒杂交瘤细胞构建及单克隆抗体制备

TGEV-PL株在PK15细胞上增殖,经浓缩纯化获得TGEV抗原,建立了间接ELISA检测方法.应用杂交瘤技术获得3株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞.经检测其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤细胞染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,腹水抗体效价达1∶6×104,与6株毒(菌)株的抗原之间无交叉反应.经阻断试验证实,其分泌的McAb能识别抗原是TGEV所特有的抗原决定基.     

抗猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及其部分特性鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合,间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法进行细胞克隆,经过3次克隆筛选,最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系(命名为E10F10D5),其染色体平均记数为87±10对,间接ELISA检测制备的腹水效价达1:12 800,以全病毒为抗原对杂交瘤细胞(E10F10D5)产生的腹水进行Westernblot分析,该腹水识别病毒结构蛋白质分子量约43ku,即TGEV天然N蛋白.     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用猪传染性胃肠炎（TGEV）华毒株弱毒H－155代感染iBRS2传代细胞，通过冻融、PEG6000沉淀、蔗糖密度梯度离心提纯制备的TGEV抗原，免疫BALB／C小鼠，取血清抗体阳性的免疫鼠的脾细胞，在50％PEG4000作用下，与SP2／0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，产生杂交瘤，用ELISA间接法对杂交瘤细胞生长孔上清液进行检测，筛选阳性杂交瘤细胞株。通过有限稀释法进行3次克隆，获得了2株分泌抗TGEV的单克隆抗体杂交瘤细胞株，并对其所分泌的单克隆抗体免疫球蛋白亚类、特异性、中和反应性等特性作了初步鉴定。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

猪传染性胃肠炎病毒基因工程研究进展

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是猪的一种重要的传染病病毒，给养猪业造成巨大经济损失。近几年来，随着分子生物学技术的广泛应用．在TGEV的各个方面的研究都取得了长足进展．积累了丰富的资料。本文就来对TGEV的基因工程研究进展作一介绍。     

抗猪传染性胃肠炎M蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒重组M蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合、筛选,最终获得3株抗TGEVM蛋白的杂交瘤细胞系1B3、3C2、4A5,染色体平均记数为89对、92对、90对,间接ELISA检测1B3、3C2、4A5细胞培养上清的效价分别为1/4000、1/1000、1/4000,腹水效价分别为2×10~4、2×10~5、2×10~5。通过间接ELISA做病原检测,这3株单抗不与猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,而与传染性胃肠炎病毒显示良好的特异性。用制备的单抗通过间接免疫荧光做病原检测,发现染色后TGEV感染的细胞培养物在胞浆和细胞膜上出现黄绿色荧光,未接种病毒的细胞培养物未见有黄绿色闪亮荧光,结果表明,所制备的抗重组TGEVM蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为TGEV准确快速的病原诊断和TGEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒的血凝位点的定位研究

通过转瓶培养ＩＢＲＳ２细胞，选择最佳接毒剂量、接毒时间和收毒时间生产出凝集价（ＨＡ）达２１２的猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）血凝抗原。用抗ＴＧＥＶＳ蛋白和 Ｍ蛋白的单克隆抗体与不同稀释度的ＴＧＥＶ血凝抗原等量混合，在 ３７℃作用 ３０分钟后接种ＩＢＲＳ２细胞和做中和试验（ＮＴ）和血凝抑制（ＨＩ）试验。结果表明ＴＧＥＶ血凝位点与中和位点一致，血凝素位于Ｓ蛋白Ａ位点或其附近。     

猪传染性胃肠炎病毒NSP5蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)NSP5蛋白的单抗隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以原核表达并纯化的重组NSP5蛋白(r NSP5-GST)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛出一株稳定分泌抗TGEV NSP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(5C3)。MAb亚类鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶6 400和1∶105。Western blot鉴定表明该MAb能够识别原核及真核表达的NSP5重组蛋白。利用肽扫描法鉴定显示,该MAb识别的抗原表位为286EFTPTEVIR QMYGVN300。本研究制备的MAb及其抗原表位的鉴定,为TGEV NSP5蛋白结构和功能的研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白C和D抗原位点在大肠杆菌中的串联表达

使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白C和D抗原位点多肽基因序列。依次将C和D抗原位点多肽基因序列克隆至表达载体p ET-32a中。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析。结果显示,在分子量25 k Da处有1条明显的蛋白表达条带,且能被TGEV阳性血清识别。本研究为TGEV的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳N蛋白基因的克隆与鉴定

根据文献已发表的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）cDNA基因序列，设计和合成1对引物，以TGEV TH-98强毒株基因组mRNA为模板，通过RT-PCR技术扩增其N基因：将RT-PCR产物按正确的阅读框架（ORF）定向克隆到载体pProEXHTb上，重组质粒PHN转化进大肠埃希氏菌DH5a株，通过酶切分析及序列测定表明已成功获得了TGEVN基因的无性繁殖体系。TH-98强毒株的N基因的Purdue-115株、FS772/70株、TO14株、96-1933株及TF I株的核苷酸序列的同源性分别为99%、97%、975、95%和96%，氨基酸序列的同源性分别为99%、97%、98%、96%和97%。     

分泌抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与鉴定

用纯化的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)免疫Balb／c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术．取脾细胞与NSn骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选，3次有限稀释法克隆，得到1株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株：6Pg。经鉴定，该单抗为IgG1亚类，杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条，杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1：256和1：20480。经Western-blot鉴定为针对N蛋白的单抗。6Pn株单克隆抗体与伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒均不发生交叉反应，显示出良好的特异性。连续培养20代后能稳定分泌抗体。此单克隆抗体的获得为PRRSV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的原核表达与纯化

为制备高致病性的TGEV毒株重组S蛋白,试验将重组质粒pET28a-TGEV-S2、pET28a-TGEV-S3,转化至E. coli BL21(DE3)表达菌株,设置不同的诱导温度、IPTG浓度和诱导时长对其进行表达条件的优化,并使用纯化试剂盒将其纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果表明,重组TGEV毒株S蛋白的分子量分别约为28 kDa、30 kDa,在不同诱导条件下均以包涵体形式存在,在28℃条件下以终浓度为1 mmoL·L^-1 IPTG诱导4 h表达量达到最高。结果表明:试验成功制备了TGEV重组S蛋白,为TGEV抗体检测试剂盒和基因工程疫苗、检测试剂的研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备及其在检测组织中病毒的初步应用

旨在建立一种在感染初期对猪传染性胃肠炎(TGE)进行快速准确诊断的方法。本试验使用猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)经蔗糖梯度离心后用于免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经4次亚克隆及Western blot、间接免疫荧光(IFA)鉴定后筛选出1株能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株3G11。通过试剂盒将3G11单抗与辣根过氧化物酶(HRP)偶联,然后以HRP-3G11作为一抗,利用免疫酶组织化学法检测小肠组织病料中的TGEV。结果表明：HRP-3G11作为一抗经镜检可见特异性红棕色沉淀,即HRP-3G11单抗可以与小肠组织中病毒发生特异结合,试验过程耗时少且可视化显色结果优于未标记一抗使用酶标二抗组,证实了标记后单抗HRP-3G11可以作为直接检测抗体应用于免疫酶组织化学法中检测用小肠组织中的TGEV。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。     

二种方法检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的比较

分别用血清中和试验和单克隆抗体阻断酶联免疫吸附试验对８１头美国进口猪轿清作猪传染性胃肠炎抗体检测。ＳＮ试验同７份阳性血清，检出率为８．６４％，Ｂ－ＥＬＩＳＡ试验检出７份ＰＲＣＶ抗体阳性血清，检出率为８．６４％，无ＴＧＥ阳性。ＳＮ试验检出７份ＴＧＥ抗体阳性血清与Ｂ－ＥＬＩＳＡ试验检出的７份ＰＲＣＶ抗体阳性血清完全重合。结果证明，应用单克隆抗体进行的Ｂ－ＥＬＩＳＡ可鉴别诊断ＴＧＥ与ＰＲＣＶ感染，优于Ｓ