伪狂犬病病毒鄂A株TK—／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5．9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点，然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点，构建转移质粒pUEKPZ，该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待完全病变后在X－gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增，Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ 突变株。     

伪狂犬病病毒鄂A株 TK－／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI／KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5.9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI／KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHI位点，构建转移质粒pUEKPZ。将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK-15细胞，待完全病变后在X-gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增、Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK     

伪狂犬病病毒鄂A株gG－／LacZ＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphⅠ／KpnⅠ片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ，将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK-15细胞，待细胞完全病变后，在X-gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG     

伪狂犬病病毒鄂A株gG-/LacZ+突变株在不同细胞中增殖规律的研究

伪狂犬病病毒 (Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ ,ＰｒＶ)属疱疹病毒科α 疱疹病毒亚科 ,能引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病 ,尤其是猪的伪狂犬病 ,已成为危害当今养猪业的最严重的传染病之一。根据已成功根除伪狂犬病国家的经验以及伪狂犬病病毒分子生物学研究的新成果 ,种猪的免疫还是以灭活苗为主。但传统的灭活苗由于缺少检测标志 ,无法采用鉴别诊断方法区分疫苗免疫猪和野毒感染猪。而在目前广泛使用的三种基因缺失标志疫苗株 (ｇＧ- 、ｇＥ- 、ｇＣ- )中 ,由于 ｇＧ的缺失不影响免疫原性 ,因此 ,ｇＧ- 灭活苗优于 ｇＥ- 、ｇＣ-…     

伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定

合成了 １ 对能对伪狂犬病病毒（ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ（ｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）基因＋ １１９～＋ １ ０７１区进行特异扩增的引物,用猪 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株细胞培养物提取的基因组作模板,扩增出 ９５３ ｂｐ 长的片段,用地高辛标记该片段作探针,通过 Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ 杂交,从克隆有 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的重组质粒中钓出含 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ。对 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ 进行酶切分析,绘制了含 Ｔ Ｋ 基因的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的图谱,通过测序得出了 Ｔ Ｋ 基因的全序列。将该序列与 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｉ Ａ３ 株 Ｔ Ｋ 基因进行比较,发现鄂 Ａ 株的 Ｔ Ｋ 基因存在变异。     

SABC法对伪狂犬病病毒鄂A株在仔猪体内的定位

运用免疫组织化学SABC法对人工感染伪狂犬病病毒的仔猪部分组织进行组织学观察。结果显示，在肺、大脑、小脑、脊髓、脊神经节、淋巴结、扁桃体、胸腺、脾、肝、肾、肾上腺、胃、肠等组织内均发现阳性细胞，尤其在肺、神经组织和淋巴组织内为多，病毒主要侵害上皮细胞、神经细胞和淋巴细胞，主要存在于被感染细胞的胞浆和胞核内，但以胞浆内为主。     

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒，对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞(RK)上和鸡胚成纤维细胞(CEF)上连传5代．均出现典型细胞病变．再接种于RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK15细胞和143TK细胞，均出现典型细胞病变；在RK-13细胞上的TCID50为10^-0.52/0．1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子；对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；病毒接种于家兔和小鼠，均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA作为模板。应用特异性引物，以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gD基因中272～534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明，所分离病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁A株。     

猪伪狂犬病病毒双基因缺失突变株(HB-98株)安全性、稳定性和免疫原性测定

对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株（PrV HB-98株）的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明，PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50／0．1mL以上，与亲本毒株相当，但高于Bartha株；与PrV鄂A株相比，病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB／c小鼠的死亡，毒力也低于Bartha株；将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次，各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增，未出现毒力回复现象．表明该毒株具有良好的遗传稳定性；以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔．仔猪也未出现任何临床症状，证明该毒株有较好的安全性。另外，以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，分别于接种后28d和20d，用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击．结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击．获得保护，表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明，PrV HB-98株可以作为候选毒株．用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。     

伪狂犬病病毒Min—A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物，对PRVMin—A株进行了PCR扩增，扩增产物克隆于pGEM—TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明，目的片段包含1个1740bp的开放性阅读框(ORF)，编码由579个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明，PRVMin—A株与PRVEa株、SH株PE基因的核菩酸同源性分别为99．2％、98．7％；推导氨基酸的同源性分别为98．6％、97．2％。     

伪狂犬病病毒Bartha株TK-/LacZ+突变株的构建及其生物学特性研究

本研究将伪狂犬病病毒Bartha株基因组与含有LacZ标志基因的TK基因转移质料pUEKPZ共转染猪肾传代细胞PK－5，细胞出现病变后，反复冻融3次收毒，按1：5稀释接种于IBRS－2细胞。在X－gal存在下挑取蓝斑，蓝斑筛选3次，再进行空斑试验，同时用PCR扩增LacZ基因，经3次空斑纯化，随机挑取的空斑均能扩增出LacZ基因，证实所获得的重组病毒为伪狂犬病病毒Bartha株TK^-/LacZ^ 突变株。TCID50试验表明，TK失活对Bartha株在细胞上增殖无影响；Balb/C小鼠试验表明，该突变对Balb/C小鼠的安全性明显高于Bartha亲本毒株。     

伪狂犬病病毒Fa株gp63（gⅠ）基因转移载体质粒的构建

用限制性核酸内切酶Sall酶切已缺失gⅠ（gE）和部分gp63(gⅠ)的重组质粒PPB7－1DNA后。回收大小约6.0kb片段，经T4DNA连接酶接后转化入大肠杆菌DH5α株，得到含gp63片段的转移载体质粒PP63，再以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β－半乳糖苷酶（LacZ）基因作为报告基因，将其手稿P63中gp63基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点，在选择培养基中筛选出表达β－半乳糖苷酶的转化子，构建了以gp63为同源序列含LacZ报告基因的转移载体质粒，命名为PP63LacZ。在该转移载体质粒中，LacZ基因的两端分别与0.3kb和0.5kb的PRV gp63同源序列相连，经酶切、核酸分子杂交技术鉴定，结果表明该转移载体质粒的构建是成功的。     

伪狂犬病病毒Ea株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上，下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒，pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了 gD基因的可靠性和完整性，同时构建了测序质粒pSKgDSB,pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序，将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残苦水平上也有差异。     

伪狂犬病毒变异株（JS-2012）对仔猪的致病性研究

本实验室2012年从江苏省太仓市某发病猪场分离到1株变异的伪狂犬病毒,命名为JS-2012。为了研究该分离株对仔猪的致病性,将12头15日龄的伪狂犬病毒阴性仔猪随机分为3组,其中2组（每组5头猪）分别通过肌肉注射和滴鼻接种JS-2012毒,第3组2头猪做空白对照。接种病毒的仔猪在攻毒后24 h体温均开始升高,4 d后开始死亡,死亡率为100%。临床观察发现,滴鼻组仔猪发病死亡明显快于肌肉注射组。对病死猪进行剖解,均可见大脑血管扩张并出血等典型的伪狂犬病病理变化。病理切片显示猪的脑蛛网膜下腔严重出血,其他各脏器也均有严重病理变化。结果表明该变异株JS-2012为伪狂犬强毒毒株。     

伪狂犬病病毒YN株与闽A株、苏联林交叉对流免疫电泳试验

应用豚鼠制备伪狂犬病病毒高免血清,运用醋酸透析法制备伪狂犬病病毒沉淀抗原,通过交叉对流免疫电泳试验,证明伪狂犬病病毒YN株与闽A株、苏联株之间有共同抗原。本试验建立的对流免疫电泳方法,可供我国开展伪狂犬病的诊断研究参考。     

伪狂犬病毒DNA限制性内切酶分析

应用５种限制性核酸内切酶（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｌⅠ、ＢｇｌⅡ和ＨｉｎｄⅢ）建立了伪狂犬病毒闽Ａ株ＤＮＡ的内切酶图谱，并与Ｂｕｋ株、Ｓｈｏｐｅ株、Ｎｏｒｄｅｎ株、Ｓ株，台湾ＮＴＵ株进行比较，认为闽Ａ株与美国或欧洲毒株无关，而与台湾株同源，表明核酸限制性内切酶分析在伪狂犬病病毒研究中是一种毒株鉴别、分子流行病学调查的有用工具。     

UL46基因移码突变对PRV毒力的影响

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(JS-2012株)在Vero细胞上40℃传代培养120代后,获得了1株弱毒株(JS-2012-F120株)。该毒株UL46基因3'端有29个碱基插入,导致了130个氨基酸突变。为了研究UL46基因移码突变对PRV生物学特性的影响,本研究用JS-2012-F120的ΔUL46基因替换了JS-2012的UL46基因,构建了重组病毒JS-2012-ΔUL46,并对该重组病毒、高温传代毒株(JS-2012-F120)及其亲本强毒株(JS-2012)在细胞上的生长特性和对小鼠的毒力进行了比较分析。结果显示,与亲本毒株(JS-2012)相比,传代毒株(JS-2012-F120)病毒滴度明显提高,对小鼠的毒力明显减弱;重组病毒(JS-2012-ΔUL46)在Vero细胞上的生长趋势没有明显改变,对小鼠的毒力减弱。因此,UL46基因移码突变对PRV在Vero细胞上的复制没有明显影响,但减弱了PRV对小鼠的毒力。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究

对PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明，该基因缺失疫苗10^5.0TCID50和10^6.0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的，并可保护妊娠母猪抵抗10^7.1 TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后，gE鉴刖ELISA试验表明，PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以10^5.0 TCID50和10^6.0 TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物，结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象，说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。     

猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗（LA-A株）的最小免疫剂量和制品保存期的研究

本研究将伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(PRV AH02LA株)的gE基因缺失株(LA-A株)接种BHK-21细胞,经纯悬浮培养制备抗原,甲醛灭活后制备油乳剂灭活疫苗,并确定该灭活疫苗的最小免疫剂量和效力检验方法,以及在2~8℃保存期。结果显示:猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗(LA-A株)的效力检验方法为以2.0 mL(抗原含量108.20TCID50)接种4~5周龄PRV阴性健康仔猪,颈部肌肉注射,间隔28 d以相同剂量和方法加强免疫,加强免疫后第21 d,免疫猪血清PRV抗体中和指数应不低于10000,攻毒保护率应不低于80%;最小免疫剂量为1.0 mL(抗原含量107.90 TCID50);制品保存期:在2~8℃保存期为18个月。该研究结果为新型疫苗的研制提供了重要的试验依据。