稻瘟病菌致病性增强突变体B11的基因分析

 在农杆菌介导转化（AtMT）的稻瘟病菌突变体库中,筛选到一个菌丝生长增快,对大麦致病性增强的突变体B11。Southern杂交分析表明B11中T DNA为单拷贝插入。通过TAIL PCR克隆插入位点侧翼序列,序列测定与比对分析显示T DNA位于假想基因MG01679的编码区内。利用PCR的方法,克隆基因的DNA和cDNA序列。该基因开放阅读框包括1个内含子和2个外显子,编码序列的长度为696 bp,编码231个氨基酸的多肽,编码产物属于ThiJ/PfpⅠ蛋白家族。因此,将该基因命名为MgThiJ1。MgThiJ1蛋白序列与尖胞镰刀菌假想蛋白FOXG_09029有57%的同源性,与禾谷镰刀菌假想蛋白FGSG_08979有54%的同源性。MgThiJ1基因可能为致病过程的负调控因子,其具体作用机制有待进一步研究。     

稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选

利用农杆菌T-DNA介导的遗传转化体系转化稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)Y34菌株,平均每转化1.0×106个稻瘟病菌分生孢子可得到约300个抗潮霉素菌株。用该转化体系转化和筛选,获得抗潮霉素菌株6855个。PCR检测结果表明,所有表现抗潮霉素菌株均含抗潮霉素基因,说明抗潮霉素特性是T-DNA携带潮霉素基因插入Y34基因组的表型效应,即抗潮霉素菌株是T-DNA插入突变体。对56个突变体DNASouthern检测结果表明,有27个突变体是单拷贝插入,突变体T-DNA插入拷贝数平均为1.43。随机取1600个突变体进行致病力测定,结果发现23个突变体完全丧失致病能力。     

黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pita及其同源基因的检测与分析

【目的】为了检测黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pita及其同源基因分布情况与变异机制,了解其变异类型的致病表型。【方法】采用3个无毒基因AVR-Pita1、AVR-Pita2和AVR-Pita3的特异性引物,对202个采自黑龙江省各稻区的稻瘟病菌单孢分离菌株的DNA进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测分析,挑选不同带型和不同地区代表菌株的PCR产物进行测序。测序结果与相应无毒基因序列进行碱基与氨基酸序列的比较分析,并利用水稻抗性单基因系,对不同变异类型的稻瘟病菌株进行功能验证。【结果】AVR-Pita1的出现频率为36.14％,AVR-Pita3出现频率为59.41％。AVR-Pita2在黑龙江省202个菌株DNA中未扩增出目的条带。对AVR-Pita1和AVR-Pita3的部分PCR产物进行序列分析,检测出AVR-Pita1有5种变异类型,它们是AVR-Pita1-1、AVR-Pita1-A、AVR-Pita1-B、AVR-Pita1-C和AVR-Pita1-D。经功能验证,AVR-Pita1-1、AVR-Pita1-A、AVR-Pita1-B和AVR-Pita1-D无毒功能丧失。而无毒基因AVR-Pita3未检测出变异菌株。【结论】AVR-Pita1变异能力较强,导致大多数菌株无毒功能丧失,需与其他抗性基因搭配使用。在黑龙江省稻瘟病菌生理小种中未发现AVR-Pita2基因。AVR-Pita3基因序列在菌株中比较稳定。     

稻瘟病菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1的功能研究分析

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是一种在水稻不同生育期均能引起病害的真菌。在真核生物中,蛋白激酶CK2高度保守,包含2个调节亚基和2个催化亚基。稻瘟病菌中MoCKb1和MoCKb2分别编码MoCK2的2个调节亚基,MoCKa编码稻瘟病菌MoCK2的催化亚基。运用反向遗传学策略和同源重组原理,对MoCKa-GFP的pull-down实验结果中获得的一个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1进行功能分析。经过生物信息学研究分析发现Ppz1在不同的真菌中具有不同的功能,同时与其他模式真菌的Ppz1蛋白序列具有较高同源性。在获得基因敲除突变体后,通过表型分析发现,与野生型Ku80相比,ΔMoppz1突变体菌落的营养生长和产孢量等方面均无明显差异,但分生孢子的萌发和附着胞的形成滞后于野生型菌株,且对水稻的致病能力减弱。激光共聚焦显微分析表明,MoPpz1定位在菌丝、分生孢子和附着胞的细胞质中。综上所述,蛋白磷酸酶MoPpz1可能参与稻瘟病菌分生孢子萌发、附着胞形成以及对水稻致病性的调控。     

稻瘟病菌一个假想几丁质酶的表达分析

为研究稻瘟病菌几丁质酶在稻瘟病菌形态建成和致病过程中的作用,对稻瘟病菌MGG_08054.6编码的一个假想几丁质酶进行生物信息学分析、基因表达及其融合蛋白分泌特性研究.结果显示:稻瘟病菌基因MGG_08054.6编码的蛋白MoChil与里氏木霉、桔绿木霉、烟曲霉、禾布氏白粉菌已知的18家族几丁质酶(EC 3.2.1.14)蛋白序列同源性大于40%,并具有几丁质酶催化区域的两个保守基序GGW和DG-D-DWE及部分几丁质结合区的活性位点,该蛋白序列经程序SignalP 3.0分析含有信号肽,在16T-17S和26Q-27S处有两个可能的剪切位点;将MGG 08054.6基因在稻瘟病菌Guy11进行过量表达,获得分泌蛋白,证明了该蛋白的分泌特性.半定量RT-PCR分析表明,该基因在不同生长发育阶段及侵染水稻阶段均有表达,其中菌丝阶段表达量最高.     

中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株无毒基因的分离及功能鉴别

 白叶枯病菌与水稻间的互作符合基因对基因模式,不同小种中存在特异的avrBs3/pthA家族基因。对中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株基因组DNA进行BamHⅠ酶切和Southern杂交,发现了其特有的约6.0 kb大小、含avrBs3/pthA家族基因的信号条带。经文库筛选、Southern杂交和限制性酶切分析,获得了C8小种avr/pthC8a基因。将该基因导入菲律宾小种6 的代表菌株PXO99A中,发现avr/pthC8a可使PXO99A丧失对水稻品种Asominori（携有成株期抗性基因Xa17）的毒性,暗示avr/pthC8a可能是与Xa17相应的无毒基因。序列分析发现,avr/pthC8a基因大小为3816 bp,编码1272个氨基酸,由102 bp编码的34个氨基酸重复单元在基因内的重复数为20.5个,其3′端的BamHⅠ酶切位点由GGATCC突变为AGATCC,其他特征均与avrBs3/pthA家族的成员相似,即C端存在1个亮氨酸拉链、3个核定位信号和1个酸性转录激活域。avr/pthC8a基因3′端的BamHⅠ酶切位点发生突变在avrBs3/pthA家族基因中鲜有报道。中国C8小种avr/pthC8a基因的发掘,为进一步了解水稻黄单胞菌毒性变异以及avrBs3/pthA家族基因的进化提供了理论依据。     

稻瘟病菌类LxAR家族基因的预测及表达分析

在侵染水稻过程中,稻瘟病菌分泌一系列效应因子来抑制寄主免疫系统。无毒效应因子AVR Pii和AvrPiz-t的氨基酸序列含有类LxAR基序,基于此,本研究利用生物信息学技术,从稻瘟病菌基因组中筛选获得了99个含有类LxAR基序的假定效应因子(MoLLEs)。该家族蛋白都为小分子蛋白(70~300 aa),富含半胱氨酸氨基,绝大多数为未知功能的蛋白。24个蛋白含已知的功能域,可能涉及了多种生命过程,其中有9个蛋白编码植物细胞壁降解酶。通过表达模式分析发现,MoLLEs家族基因成员的表达受到饥饿胁迫、附着胞生长发育以及侵染水稻等过程的诱导,此外一部分基因受到附着胞发育关键基因PMK1调控。基因表达交叉分析表明,部分基因同时在附着胞发育和致病过程中上调表达。在与水稻的相互作用中,MoLLEs在稻瘟病菌侵染不同阶段均有上调表达,并且部分基因受亲和或非亲和反应特异性诱导。      

稻瘟病菌大片段DNA转化载体的构建

构建能够转化大片段DNA的载体是进行基因簇功能分析的重要手段。利用cosmid载体和pBHt2载体构建了一个可以在稻瘟病菌中转化大片段DNA的载体,通过农杆菌介导的转化方法,成功地将超过30kb的大片段DNA转化到稻瘟病菌中。研究结果将促进稻瘟病菌基因簇的功能分析。     

稻瘟病菌不同拼接版本基因组序列差异性比较

为了明确稻瘟病菌不同拼接版本基因组序列的差异,促进合理利用不同拼接版本基因组序列,比较了不同版本稻瘟病菌基因组数据库微卫星序列的分布情况,功能基因的位置及长度差异,SSR引物的位置差异等。结果表明,不同基因组数据库在序列长度上差异明显,功能基因的位置、SSR引物位置和SSR核苷酸重复类型数量也差异明显。无毒基因Avr-Pizt连锁标记比较分析表明Avr-Pizt基因定位在不同数据库中差别明显。不同稻瘟病菌数据库中,第7染色体的序列与其上的BAC序列之间差异显著,虽然这不影响功能基因的分析,但影响无毒基因图位克隆的定位区间的判断。因此,稻瘟病菌研究者应根据实际情况选择相应的数据库。     

Pathogenicity of Rice Blast Fungus Magnaporthe oryzae on Brachypodium distachyon

Inoculation methods for rice blast fungus Magnaporthe oryzae to Brachypodium distachyon were developed to investigate the infection process and symptom development in comparison with those on rice (Oryza sativa) and barley (Hordeum vulgare).M.oryzae could infect leaves,sheathes,stems and panicles of B.distachyon and cause blast disease.Spraying conidial suspension on either intact seedlings or leaf segments induced typical symptoms on B.distachyon.During the intact seedling inoculation,the symptom developed on B.distachyon leaves closely resembled that on rice;but the lesions on B.distachyon had better uniformity in shapes and sizes than those on rice or barley.In the leaf segments inoculation,only initial and low-developed lesions could be found on rice,while normal symptoms on B.distachyon and barley.Inoculated with low-virulent mutants of M.oryzae,B.distachyon produced low-level symptoms.The symptom level of each mutant on B.distachyon corresponded well to that on rice.In addition,typical infection processes presented on B.distachyon leaves:forming melanized appressoria,penetrating into host epidermis and then forming hyphae in epidermal cells.According to these results,B.distachyon can be used as a candidate for studying fungus-plant interactions and as a probable source of disease resistance.     

稻瘟病菌对新型模式植物二穗短柄草的致病性研究

 建立了稻瘟病菌对二穗短柄草的接种体系,观察了稻瘟病菌在二穗短柄草上的发病过程和特点,并与在水稻和大麦上的发病情况进行了比较。在人为接种稻瘟病菌的条件下,二穗短柄草的叶片、叶鞘、茎秆、穗部均可获病。利用稻瘟病菌孢子悬浮液对二穗短柄草进行苗期活体或离体接种,都能引发典型病斑。与大麦相比,二穗短柄草叶片上病斑的出现时间及发展速度更接近水稻。同时,二穗短柄草叶片上的接种和发病条件比水稻更易控制,病斑更具一致性。另外,稻瘟病菌致病突变体在二穗短柄草叶片上致病性变化（降低或丧失）趋势与在水稻上的情况一致。显微观察及组织化学染色表明,稻瘟病菌在二穗短柄草叶片上可有效形成附着胞,侵入叶片表皮细胞,形成典型的侵染菌丝,其过程与水稻近似。因此,二穗短柄草可以作为稻瘟病菌与寄主互作的研究材料,并有望为杂草上梨孢菌的研究提供可能的模式植物以及为农作物的抗病育种提供参考。     

稻瘟病菌分泌蛋白质在致病过程中的作用初探

  鉴定了稻瘟病菌孢子萌发过程中分泌产生的蛋白质。将稻瘟病菌菌株2005 50、2005 81未萌发孢子、萌发孢子以及含有孢子萌发液的萌发孢子分别接种后,病情指数分别为11.13, 35.06, 49.01和49.6, 8.4, 62.7;说明孢子萌发液中具有能够帮助稻瘟病菌侵染的物质。利用SDS PAGE电泳分析稻瘟病菌孢子萌发液,发现孢子萌发液中含有蛋白质类物质。进一步利用生物质谱鉴定和数据库资源检索,共检索到8个稻瘟病菌的蛋白质基因,其基因编号分别为MGG_01305,MGG_13188,MGG_12454等。提示这些蛋白质可能在稻瘟病菌侵染过程中具有重要的功能。     

稻瘟病菌中小G蛋白Rho3的假定互作蛋白MoKin1的功能分析

小G蛋白MoRho3在稻瘟病菌生命活动中具有重要的生物学功能。前期研究表明,MoRho3的缺失对于稻瘟病菌分生孢子的形态建设、附着胞萌发和侵入能力以及对宿主的致病性等表型都存在严重缺陷。为了进一步解析MoRho3在稻瘟病菌中的网络调控途径,通过生物信息学的方法预测了MoRho3的互作蛋白。在众多假定互作蛋白中,蛋白激酶MoKin1与酿酒酵母中KIN1和KIN2是同源蛋白。在酵母细胞中,KIN1和KIN2可以抑制△rho3的表型缺陷。为了验证在稻瘟病菌中MoKin1与MoRho3之间是否存在着相似的调控途径,本研究通过分析MoKin1与同源蛋白的进化关系,序列结构,定位状态以及相关的互作蛋白,揭示了MoKin1的功能特点,为后续病原菌中MoKin1与MoRho3互作机制的研究,以及病原菌致病机制的解析提供了新的思路和方向。     

ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析

【目的】真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。【方法】采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。【结果】Mo MET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因Mo MET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。Mo MET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。【结论】无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。     

Virulence Types of Magnaporthe oryzae to Hybrid Rice in Sichuan,China

A total of 638 isolates of rice blast(Magnaporthe oryzae) were isolated in 2002-2009 from different rice varieties in different regions of Sichuan,China and inoculated onto seven rice varieties(Lijiangxintuanheigu,IR24,Minghui 63,Duohui 1,Chenghui 448,Neihui 99-14 and RHR-1) to differentiate the virulence types of the fungus and trace the changes.The virulence to the seven varieties was respectively scored at 1,2,4,8,16,32 and 64.The total scores of individual M.grisea isolates which were the sum of scores infecting differential varieties could,in turn,be used for the nomenclature of the virulence types due to their accordance to the special virulence patterns.The 638 tested isolates were then differentiated into 56 different virulence types.Type 15 virulent to Lijiangxintuanheigu,IR24 and Minghui 63,and Type 127 virulent to all of the seven varieties were the most dominant virulence types respectively with the occurrence frequencies of 15.99% and 15.83%.Type 19 and other seven virulence types were not monitored during 2002-2009.Type 15 was the predominant virulence type in 2002,2003,2004 and 2007,whereas Type 127 had been the most dominant virulence type after 2005 except for the year 2007 when the province underwent severe drought.Five hundred and seven out of the 638 tested isolates were virulent to Minghui 63,and 89.58% of the 384 isolates virulent to either Duohui 1,Chenghui 448 or Neihui 99-14 were virulent to Minghui 63,which indicated the impact of the extensive plantation of hybrid rice Minghui 63 as the restorer line on the virulence evolution of M.oryzae in Sichuan.The virulence pattern of the dominant virulence types suggested that the acquiring of virulence to all the major resistant restorer lines was the main routes of the evolution in virulence of M.oryzae to hybrid rice in Sichuan.The virulence frequencies of the 638 tested isolates to IR24,Minghui 63,Duohui 1,Chenghui 448,Neihui 99-14 and RHR-1 were respectively 74.6%,79.5%,73.8%,37.0%,39.0% and 40.4%.The analysis for the sources of the different virulence type isolates indicated the pathogen on the newly released resistant varieties were stronger than conventional rice varieties which had become susceptible in the field since 1980s.     

利用卡氏白和尼罗红染色观察稻瘟病菌有性世代的结构

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是异宗配合的子囊菌,但至目前,关于其有性世代产生过程和结构的研究相对较少。本研究利用两个稻瘟病菌菌株Guy-11与2539在多种培养基上进行杂交试验,观察有性世代产生情况。结果表明,两菌株在所有参试培养基上杂交后均能产生子囊壳,但子囊壳的数量、产生速度和成熟度各不相同,以燕麦培养基为最佳。为了进一步观察有性世代的结构,我们采用卡氏白和尼罗红对子囊和子囊孢子进行染色和荧光观察。荧光显微镜下,子囊和子囊孢子的细胞壁均能被卡氏白染成清晰的亮蓝色,细胞结构清晰可辨。成熟的子囊壳内可产生大量的子囊,子囊中含有8个子囊孢子,子囊孢子通常含有4个细胞。同时,子囊孢子能够被尼罗红染成橘红色,表明子囊孢子中储藏大量的脂肪类物质。本研究提供了一种有效的观察稻瘟病菌有性世代结构的荧光染色方法,为后续的研究奠定了基础。     

四川省稻瘟病菌群体遗传结构分析

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病是全球水稻生产上最严重的病害之一。利用6对SSR荧光标记对采自四川绵阳、营山、雅安、北川和武胜地区的5个稻瘟病菌群体的遗传结构进行分析。结果表明,在124个稻瘟病菌中检测出43个等位基因,平均每个位点的观测等位基因数为7.2,有效等位基因数为3.1,所有位点均显著偏离HardyWeinberg平衡。5个群体的平均观测杂合度(0.374)低于期望杂合度(0.502),暗示群体内存在因近交而导致的杂合子缺失。AMOVA分析显示,绝大多数遗传变异(81.17%)存在于群体内个体间,仅有18.83%的变异来自于群体间的差异。5个地理群体间呈现高水平的遗传分化(遗传分化系数为0.057~0.528)。Mantel检验表明,群体间的遗传距离与地理距离相关未达显著水平,说明稻瘟病菌的遗传变异呈现随机分布的空间模式。群体遗传学数据分析表明5个群体间存在不同程度的基因流(基因流水平为0.472~4.347),基于贝叶斯聚类法的Structure分析也证实了这一结果。     

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。     

南繁区稻瘟病菌遗传多样性和群体遗传结构的AFLP分析

【目的】为了明确南繁区稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的遗传分化情况,【方法】采用AFLP分子标记技术对南繁核心区(三亚、乐东和保亭)和非核心区(琼中、屯昌和定安)共60个稻瘟病菌菌株的遗传多样性和群体遗传结构进行了比较分析。【结果】聚类分析表明,几乎所有菌株都聚在同一个谱系里,并且该谱系没有明显的亚群;群体遗传结构分析表明,核心区群体的多态性位点百分率、Shannon信息指数和基因流分别为87.89%、0.2738和4.2897,高于非核心区群体的81.37%、0.2703和3.5892;然而,核心区群体的Nei基因多样性指数和基因分化系数分别为0.1657和0.1044,低于非核心区群体的0.1662和0.1223。【结论】这些结果表明核心区和非核心区菌株都存在丰富的遗传多样性,不同群体间均存在较多的基因交流,但遗传变异均主要来自群体内;相比之下,核心区菌株的遗传多样性和遗传分化程度较高。