外源C4二羧酸对转玉米PEPC基因水稻C4光合途径的促进作用

以转PEPC基因水稻和野生型水稻Kitaake为材料, 研究了不同基因型水稻叶片中的C4光合微循环及其功能。通过测定与光合C4途径有关的关键酶,如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、NADP苹果酸酶(NADP-ME)、NADP苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK),说明野生型水稻叶片中具有完整的C4光合酶体系;用外源草酰乙酸(OAA)或苹果酸(MA)饲喂叶切片或叶绿体后明显增加光合速率,证明野生型水稻中具有一个有限的光合C4微循环。将玉米的PEPC基因导入原种水稻后,可大幅度提高光合C4微循环的速率。测定不同基因型的CO2交换速率,看出水稻中C4光合微循环的增强有提高净光合速率(Pn)和降低Pr/Pn比值的作用。叶绿素荧光特性分析表明,C4光合微循环的增强伴随着PSⅡ电子传递效率(Fv/Fm)和光化学猝灭(qp)的增加,以及非光化学猝灭(qN)的降低。      

蜀恢881含玉米C4型pepc基因改良系的遗传背景及其光合特性

从通过分子标记辅助选择育成的含玉米C4型pepc基因蜀恢881中筛选10株,利用530对SSR引物进行遗传背景分析,发现与蜀恢881表现差异的位点仅有1～4个,相似度在95.15%以上,最高的达9903%。进一步对相似度为9903%的转育玉米C4型pepc基因蜀恢881的6个生长时期测定有关光合指标,表明6个时期的PEPC酶活性均比蜀恢881增强,PEPC酶活性值最大时期是拔节期,为1264.2 μmol/(mg·h）,分蘖初期增加的幅度最大达到23.3倍;其净光合速率与蜀恢881相比,在分蘖初期、分蘖盛期、拔节期和始穗期都得到不同程度的提高,其中拔节期最高,达到22.3%。研究表明通过杂交利用C4型pepc基因特征引物对C4型pepc基因进行分子标记辅助选择,能够获得携有C4型pepc基因且与受体亲本遗传背景十分接近的籼型水稻材料,而且C4型pepc基因在新的遗传背景下能够高水平表达和稳定地遗传。据此,建立了分子标记辅助选择、光合生理生化指标鉴定和田间综合农艺性状考查相结合的筛选玉米C4型pepc基因水稻的技术体系;同时认为在拔节期进行转育C4型pepc基因水稻光合生理指标的测定和筛选的效果可能较理想。     

基因后代的耐光氧化特性

分别以转PEPC Kitaake和Kitaake作父本,以4份不同来源的保持系珍汕97B、K17B、Ⅱ32B和G2480B为母本构建F1,考查PEPC 的表达及其对光合性状和农艺性状的影响。导入PEPC 后,水稻净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和PEPC酶活性均表现为增加,最突出的是其PEPC酶活性均成倍增加。蒸腾速率方面,只有K17B/PEPC 表现为下降。珍汕97B的净光合速率、气孔导度和PEPC酶活性一般配合力相对效应值均最大。在农艺性状上,G2480B/PEPC 的有效穗数、结实率和单株产量均大幅度提高,分别增加了31.46%、1.39倍和1.83倍,千粒重也增加了7.84%。珍汕97B/PEPC 由于穗变短,即使结实率和千粒重大幅度增加,减产仍达9.84%。G2480B的穗长、每穗粒数、结实率和单株产量一般配合力相对效应值均最大,而珍汕97B最小。在耐光氧化方面,转PEPC 基因Kitaake明显优于Kitaake。说明PEPC 单个基因对改善籼型三系保持系的光合性能和增加产量有较重要的作用。在供试的4份保持系中选用保持系宜考虑G2480B,PEPC 在此遗传背景下的表达丰度较高,提高结实率和单株产量等农艺性状的正效应最好。     

玉米PEPC 基因在籼型水稻保持系不同遗传背景下的效应及转PEPC基因后代的耐光氧化特性

 分别以转PEPC Kitaake和Kitaake作父本,以4份不同来源的保持系珍汕97B、K17B、Ⅱ 32B和G2480B为母本构建F1,考查PEPC 的表达及其对光合性状和农艺性状的影响。导入PEPC 后,水稻净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和PEPC酶活性均表现为增加,最突出的是其PEPC酶活性均成倍增加。蒸腾速率方面,只有K17B/PEPC 表现为下降。珍汕97B的净光合速率、气孔导度和PEPC酶活性一般配合力相对效应值均最大。在农艺性状上,G2480B/PEPC 的有效穗数、结实率和单株产量均大幅度提高,分别增加了31.46%、1.39倍和1.83倍,千粒重也增加了7.84%。珍汕97B/PEPC 由于穗变短,即使结实率和千粒重大幅度增加,减产仍达9.84%。G2480B的穗长、每穗粒数、结实率和单株产量一般配合力相对效应值均最大,而珍汕97B最小。在耐光氧化方面,转PEPC 基因Kitaake明显优于Kitaake。说明PEPC 单个基因对改善籼型三系保持系的光合性能和增加产量有较重要的作用。在供试的4份保持系中选用保持系宜考虑G2480B,PEPC 在此遗传背景下的表达丰度较高,提高结实率和单株产量等农艺性状的正效应最好。     

共转化法获得无筛选标记的转PEPC、PPDK基因水稻恢复系纯合体

用根癌农杆菌共转化的方法将pSB130/CK质粒[目的基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、磷酸丙酮酸二激酶基因(PPDK)与筛选标记潮霉素抗性基因HPT分别构建于2个T-DNA区]导入水稻恢复系R299,经PCR、Southern检测,筛选到T0代13个转基因植株。对T1～T3代转基因后代进行PCR跟踪鉴定,分离出无潮霉素抗性基因的转基因植株(PEPC PPDK HPT-),分离株系比率为15%～21%,分离株系中PEPC PPDK HPT-型单株分离频率为7.2%～10.0%。在T3代成功获得了无筛选标记的转基因纯合系3个(06D351,06D352和06D353),PEPC酶活性和光合速率分析结果表明,其PEPC活性比对照提高了1.5～4.9倍,光合速率提高了19%～40%,说明这些转基因纯系材料在水稻高光效育种上具有很大的应用价值。     

玉米C_4型全长pepc基因导入普通小麦的研究

为了获得具有类似C4光合途径的转pepc(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)基因小麦材料,采用基因枪法将玉米C4型全长pepc基因导入小麦材料01H186-20-24,经在含4 mg.L-1L-PPT(L-phosphinothricin,草丁膦)的培养基上筛选,获得抗性再生植株,经PCR检测获得118株T0代阳性植株;进一步利用PCR对T1代植株进行筛选,T2代在隔离条件下种植于大田,Southern blot、SDS-PAGE检测表明,外源pepc基因在小麦基因组中得以整合和表达。测定了40个转基因T2代植株和受体对照的净光合速率(Pn)、PEPC活性,结果表明,在大田自然条件下,82.5%的转基因小麦的Pn增加,最大提高18.57%,达到了28.1μmol CO2.m-2.s-1,转基因植株中PEPC活性为对照的1.5~1.98倍。     

转玉米C4型高光效pepc基因小麦的分子特征及光合特性研究

为分析转pepc基因小麦的分子遗传特征和光合生理特性,以基因枪介导转玉米C4型pepc基因的T3代转基因小麦株系为实验材料,对其进行PCR筛选、Southern杂交、qRT-PCR、Western杂交、酶活性和光合速率测定,鉴定了pepc基因在小麦基因组中的整合及表达情况,并分析了转基因株系的光合生理特性和产量性状表现。结果表明,玉米C4型pepc基因以1～3个拷贝的方式被整合到6个转基因株系的不同位点,且可以正确转录和翻译;6个转基因株系中有4个株系的pepc基因表达水平、PEPC酶活性和净光合速率均较对照显著提高,2个株系的单株重、单株产量和千粒重显著高于对照;抽穗期转基因株系的PEPC酶活性最大值为1.6μmol·min-1·mg-1,较对照提高了1.6倍;净光合速率最大值为29.5μmol·m-2·s-1,较对照提高了15.5%。说明,玉米C4型pepc基因可以在小麦基因组中整合表达,并可改善小麦的光合特性。     

转基因技术改良水稻淀粉品质研究进展

淀粉是稻谷籽粒主要的营养和能量储藏形式,主要由直链淀粉和支链淀粉组成。水稻淀粉品质的改良可以利用转基因技术修饰淀粉含量与质量的变化。本文综述了转淀粉合成相关基因改良水稻淀粉品质的实际案例。     

玉米C4型PEPC蛋白的生物信息学分析

利用生物信息学分析软件对GeneBank上注册的玉米C4型PEPC蛋白质序列进行氨基酸组成成分、功能域、二级结构、疏水性、亚细胞定位、导肽及进化树分析和预测.结果表明:玉米PEPC蛋白是等电点5.77的亲水性不稳定蛋白,包含一个CYTH保守结构域,定位于细胞质中,具有中央中间代谢功能,属于连接酶类.α螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件,β折叠和伸展链散布其中;玉米PEPC与高粱、水稻等植物的PEPC亲缘关系较远,不属于同一分支.     

一种简便高效的PCR辅助选择技术在杂交水稻转Xa21基因育种中的应用

介绍了一种在杂交水稻转Xa21基因育种中使用的PCR分子标记辅助选择技术.该技术结合测交和半粒种子法可以快速准确地筛选出转Xa21基因纯合株系和转[ WTBX〗Xa21基因杂交稻,大大提高育种效率,对培育抗白叶枯病杂交稻具有重要的应用价值.     

玉米C_4光合酶基因导入对拟南芥光合特性及抗旱性的影响

为了解玉米C_4型光合酶基因对C3植物拟南芥光合特性的影响及其对干旱胁迫的响应,分别以过表达ZmPEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、ZmPPDK(丙酮酸磷酸二激酶)和ZmNADP-ME(依赖于NADP的苹果酸酶)单个酶基因的拟南芥株系(分别简写为PC、PK、ME),以及过表达PEPC+PPDK和PPDK+NADP-ME两个酶基因的拟南芥株系(分别简写为PCK、PKM)为供试材料,在开花期停止浇水,并分别于干旱胁迫处理前1天、第5天、第10天和结束干旱胁迫复水处理5d时测定转基因拟南芥中目标基因的表达量、光合速率、水分利用效率和酶活性。结果表明,在正常生长条件下,PCK类型株系的PEPC酶活性、PPDK酶活性、净光合速率(Pn)以及水分利用效率(WUE)较野生型拟南芥分别高52%、20%、24%和55%,除PPDK酶活性外,PCK类型株系各指标测定值的增幅均高于其他转基因类型株系,综合表现最优。不同类型株系的上述测定指标总体表现为PCKPCPK、PKMME。干旱胁迫处理5d时,各类型株系中目标基因的表达量、光合酶活性、Pn和WUE均有所上升。干旱胁迫处理10d时,拟南芥受到严重损伤,上述指标的测定值均下降。复水5d时上述指标得到不同程度的恢复,不同类型转基因株系的各项测定指标在不同干旱胁迫处理中总体仍表现为PCK最优,PC次之。各转基因株系均优于受体非转基因拟南芥。     

利用CRISPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系

【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系，为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点，构建多基因表达载体pC1300-2×35S::g^TMS5-g^Badh2-g^Pi21，转化优质常规籼稻品种中早70，测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系。利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定，利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量进行测定。【结果】在T₀转基因株系中，Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5%、80.0%和87.5%，突变类型多为双等位突变。从T₁代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系，获得两种三突变纯合株系。稻瘟病接种结果表明，与野生型相比，T₂代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调，ROS积累量也显著增加。tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性，TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低，高温下Ub_L404基因的表达水平明显高于野生型。与野生型相比，在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调，并且香味物质2-AP含量极显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑，获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系，为高抗、香型不育系材料的选育提供参考，加快高产优质杂交水稻的选育。     

Genetic Analysis of Early Generation Stability in Rice

The mechanism of early generation stability （EGS） in rice was studied via genetic analysis. Three types of crosses were made, namely between EGS varieties, EGS and conventional rice variety, and conventional rice varieties. The genetic analysis was based on the stable lines in F2 population. The stable lines may appear from some combinations of EGS rice crossing with each other and EGS rice crossing with conventional varieties at different frequencies, but stable lines didn＇t appear in conventional varieties crossing with conventional varieties. Genetic analysis results indicated that the EGS phenomena should just exist in special rice materials, and the frequency of stable lines was closely related to the EGS traits of parents. The EGS traits were neither qualitative nor quantitative traits, and they were controlled by neither dominant genes nor recessive genes. The EGS traits might be inherited by F1 single plant, and the traits of F3 and F4 were corresponded to those of F2 population, i.e. F3 and F4 lines derived from non-segregating F2 showed uniform agronomic traits, and those from segregating F2.did not. The agronomic traits of EGS lines were consistent with those of F1 single plant. On the other hand, when EGS lines occurred, the segregating lines in Mendelian manner were also observed in all F2 population of the same combination. It was suggested that the reason why the stable strains occurred might be a special factor to control （open/close） gene at the beginning of cell division in zygote, resulting in closing mitosis and opening somatic reduction. The somatic reduction of zygote resulted in recombination and homozygosity forming in F1 single plant, and some lines with uniform agronomic traits were observed in some lines of F2 population.     

干旱胁迫咖啡嫁接苗内源激素及生物量的变化

为探明咖啡嫁接苗应对干旱胁迫其内源激素变化对植株生长的影响,布置了盆栽试验.接穗为中粒种咖啡'大丰1号',砧木分别为大粒种咖啡'查理种16号'(种间嫁接)和中粒种咖啡'热研2号'(种内嫁接),3种水分处理:(1)正常淋水土壤含水量(soil moisture content,SMC),18％≤SMC≤25％,(2)轻度...     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

秸秆还田下大气CO2浓度升高对水稻生长和CH4排放的影响

【目的】明确秸秆还田下大气CO₂浓度升高对水稻生长和稻田CH₄排放的影响,为气候变化下温室气体排放评估和丰产低碳的稻作技术创新提供理论参考和科学依据。【方法】利用开顶式气室(Open top chamber, OTC)进行田间试验,设置两个CO₂浓度处理,分别为正常大气CO₂浓度处理(简称aCO₂,CO₂浓度约为0.04%)和大气CO₂浓度升高处理(简称eCO₂,CO₂浓度约为0.055%),每个处理的田块混入等量的前茬小麦秸秆,探明秸秆还田下大气CO₂浓度升高对水稻产量等生长特性、稻田CH₄排放及微生物丰度的影响,揭示秸秆还田下大气CO₂浓度升高对CH₄排放的影响机制。【结果】大气CO₂浓度升高显著促进水稻的生长,使剑叶叶面积增加25.0%,地上生物量增加22.0%,产量提高29.0%。大气CO₂浓度升高显著增加了穗数、结实率和千粒重,但对穗粒数影响不显著。秸秆还田下,大气CO₂浓度升高有降低稻田CH₄排放的趋势,使单位产量CH₄排放量降低了39.4%。大气CO₂浓度升高使土壤甲烷氧化关键基因pmoA的拷贝数增加了20.0%,但对甲烷产生关键基因mcrA的拷贝数影响较小。【结论】秸秆还田条件下,未来大气CO₂浓度升高不仅提高了水稻产量,而且有利于减少稻田温室气体CH₄的排放。     

利用QTL-Seq定位粳稻整精米率QTL

[目的]稻米整精米率是加工品质的重要评价指标之一,其QTL定位将为提升稻米品质提供理论依据.[方法]通过两个粒型相近、整精米率差异极大的粳稻材料构建的F2分离群体为材料,利用QTL-Seq方法对分离群体中的高整精米率单株和低整精米率单株进行混池重测序以定位粳稻整精米率QTL位点.[结果]经过QTL-Seq分析发现在第8...     

多年生稻白叶枯病抗性评价

利用长雄野生稻地下茎无性繁殖特性培育多年生稻已经成功,并在生产上进行了示范推广。为明确多年生稻品种（系）对白叶枯病的抗性表现,通过田间病情调查、抗性水平鉴定和水稻白叶枯病抗性基因检测3种方法,对多年生稻品种（系）多年生稻23（简称PR23,下同）、云大24（PR24）、云大25（PR25）、云大101（PR101）、云大107（PR107）及其父本长雄野生稻、母本RD23和F₁（RD23/长雄野生稻）的白叶枯病抗性进行评价。结果表明,长雄野生稻高抗白叶枯病;尽管PR23、PR24、PR25、PR107携带白叶枯病抗性基因Xa1、Xa4、Xa23、xa25的等位基因,但在田间自然发病条件下均易感白叶枯病,说明这几个抗性基因对这4个多年生稻品种（系）不起抗病作用;而PR101在田间自然发病条件下表现为抗白叶枯病,并含有白叶枯病抗性等位基因xa25、Xa27,说明这2个基因可能是PR101抗白叶枯病的基因。本研究结果为明确多年生稻对白叶枯病菌的抗病反应,以及抗白叶枯病育种和多年生稻生产布局提供了一定依据。     

Clonal performance of perennial Oryza sativa/O. rufipogon selections and their combining ability with O. sativa cultivars for survival, stolon production and yield

In Southeast Asia, upland rice (Oryza sativa) is an annual crop typically grown for subsistence on hilly lands that are at risk for soil erosion. If perennial cultivars of upland rice were developed, they would provide farmers with an inexpensive tool to produce a preferred food while conserving soil. O. rufipogon, the undomesticated progenitor of O. sativa, includes perennial and stoloniferous forms. To evaluate the feasibility of developing perennial cultivars by combining genes of O. sativa and O. rufipogon, four trials were conducted in an upland field at IRRI: O. sativa/O. rufipogon F₁ clone and cutting height trial, F₂ family trial, and two O. sativa/stoloniferous-selection factorial mating design trials. Plants were established at the beginning of the rainy season, then subjected to a 6-month dry season and evaluated for survival after 1 year. Of the 2101 cultivar control plants, only three IR47686-1-4-B individuals survived and none produced stolons. The 18 F₁ clones, which were selected from previous trials with less drought stress, ranged in survival from 4.4 to 91.4%. Cutting height at harvest did not affect survival. Survival among the F₂ families ranged from 9.4 to 31.9%. Segregation for stolon presence did not differ from a 3:1 ratio for five of the six F₂ families, suggesting the effect of a single dominant gene. Average yields per plant for the F₂ families were 1/3 to 1/9 of yields for the cultivars. However, by crossing the F₁s to cultivars, yield potential was almost fully recovered. For the full-sib families of the factorial trials, survival ranged from 0.0 to 48.6%. Azucena and IR47686-1-4-B, both japonica cultivars, exhibited greater general combining ability for survival relative to the six other cultivar parents. Thus, the process of developing perennial cultivars of rice should include screening annual cultivars to identify those with the best combining ability for survival. To develop cultivars of perennial upland rice, drought avoidance and/or tolerance from annual upland cultivars must be combined with the capacity for perennial growth from wild perennial species. The frequency of stolonifereous testcross progeny was lower than expected and was affected by the O. sativa parent. Thus, additional genes likely affected stolon penetrance and expression. Analyses of covariance indicated that stolons improved the likelihood of survival for progenies of the factorial trials but the effect was small (b < 0.1), and that yield (g/plant) had a small negative effect on percent survival (b = −0.13 to −0.32). This study demonstrated that it was possible to introgress genes for perennial growth from wild O. rufipogon accessions into domesticated O. sativa. Additionally, strategies for developing perennial cultivars of upland rice were improved.