鸢尾黄斑病毒研究进展

鸢尾黄斑病毒是番茄斑萎病毒属一种新近检测鉴定的病毒。本文对该病毒的理化特性、传播方式、寄主范围和危害症状、检测方法和防治方法等方面进行了综述。     

南芥菜花叶病毒的几种PCR检测方法的建立和比较研究

 以进境种球中截获的带毒洋水仙和郁金香为试验材料,建立了ArMV的免疫捕获RT-PCR、巢式PCR和Real-time PCR方法,并比较了几种检测方法的灵敏度。DAS-ELISA的检测灵敏度较低,为1mg洋水仙或10mg郁金香带毒种球,而各种PCR方法的灵敏度可高于DAS-ELISA 100倍以上,其中Real-time PCR检测的灵敏度最高,可从20ng洋水仙或2μg郁金香的带毒种球中检出ArMV。鉴于DAS-ELISA灵敏度较低,建议在用ELISA初筛时,如样品OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比在2.0左右时需要再用分子方法加以确证,以防漏检。     

美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测方法的建立

本文以我国台湾进境美人蕉病株为材料,根据已报道的美人蕉黄斑驳病毒Canna yellow mottle virus(CaYMV)基因序列设计2对特异性引物(外侧引物1对、内侧引物1对),建立了巢式PCR快速检测CaYMV的方法,并对进境的50份美人蕉样品进行了检测。结果显示,该方法特异性强,且灵敏度高于常规PCR,是常规PCR的1 000倍,表明该方法能够实现对CaYMV的快速、准确、灵敏检测,适用于口岸快速检测CaYMV。     

犬细小病毒病PCR检测方法的建立及应用

犬细小病毒病感染是由犬细小病毒（cPv）引起犬只死亡的最重要传染病之一,目前诊断该病的方法主要是胶体金快速检测试板法,虽然检测方法较简便快速,但其敏感性较差。通过对NCBI网站GenBank发表的CPV-2基因组序列的分析,选择该病毒VP2基因保守序列设计引物,通过对阳性病料扩增及扩增产物测序,与NCBI发表的相关基因对比,同源性在99．8％-100％,成功建立了特异性、灵敏度高的PCR方法,最低只需2．5PgDNA模板。在对28例可疑CPV病例检测中,本方法检出25例阳性、3例阴性,阳性率为89．28％;胶体金检测板检测出20例阳性、8例阴性,阳性率为71．42％,证实PCR方法比胶体金检测更敏感。     

番茄斑萎病毒4种检测方法比较

本研究根据番茄斑萎病毒(TSWV)S RNA上的核衣壳蛋白(N)基因保守序列设计特异性引物,比较了4种检测方法的灵敏度。结果表明,特异性引物可扩增出397bp的片段,序列和已发表的TSWV核苷酸序列同源性高达99%,可用于常规PCR和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测。qRT-PCR的灵敏度比快速检测试纸条、双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和常规PCR分别高出15 625倍、3 125倍和125倍,且能够准确定量;常规PCR灵敏度较高,但不能准确定量;DAS-ELISA方法适用于批量定性测定,但检测时间较长;试纸条法检测速度最快,但灵敏度最低,使用时可根据症状程度和试验条件选择适宜的检测方法。     

甜瓜黄斑病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后的qPCR方法最适退火温度为61.3℃,最适引物浓度为0.65μmol·L^-1,特异性强,灵敏度高,比PCR高100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的qPCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.999 7。实验样品验证表明建立的qPCR方法可用于MYSV的定量检测。     

柑橘黄龙病PCR检测引物比较研究

柑橘黄龙病潜伏期长、尚无可用于大田的有效治疗药剂,快速、准确的早期检测是防控柑橘黄龙病的关键。PCR检测是目前柑橘黄龙病最常用的早期检测方法。为提高柑橘黄龙病PCR检测的准确性和检出率,本研究依据已测序的黄龙病菌全基因组序列对检测引物OI2c进行了改进（标记为OI2c-gj）,将其与其他常用的7对PCR检测引物进行了特异性和灵敏度的筛选和比较。结果表明,8对黄龙病PCR检测引物中,特异性较好的引物为OI1/OI2c-gj、Las606/LSS、P400F/P400R、A2/J5、16SF/16SR、primer1/primer2;灵敏度较好的引物从高到低依次为：OI1/OI2c-gj=Las606/LSS>P400F/P400R=A2/J5>16SF/16SR>primer1/primer2。综合比较引物特异性和灵敏度,本研究改进的引物OI1/OI2c-gj以及Las606/LSS、P400F/P400R、A2/J5对柑橘黄龙病检测有较好的准确性和检出率,建议用于柑橘黄龙病的早期检测。     

玉米褪绿斑驳病毒3种PCR检测方法的建立与比较

 以带有玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)的玉米叶片为材料,研究建立了MCMV 的普通RT-PCR、TaqMan 实时荧光RT-PCR 和SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR 检测方法,并比较了3种方法的灵敏度。结果表明:TaqMan 实时荧光RT-PCR 的检测灵敏度最高,最低检出量可达1.61 fg,SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR 略逊之,普通RT-PCR 的检测灵敏度则相对较低,与前两者相差10~100倍。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

应用PCR方法检测烟粉虱传双生病毒

番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒,根据其外壳蛋白基因保守序列设计简并引物,对杭州和海宁地区番茄上疑似番茄黄化曲叶病毒进行PCR检测,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序和序列分析,表明杭州和海宁地区发生的病毒是番茄黄化曲叶病毒,并且两地区病毒核苷酸序列同源性达97.5%。     

Analysis of Iris yellow spot virus replication in vector and non‐vector thrips species

Iris yellow spot virus (IYSV, genus Tospovirus) is a viral disease of bulb and seed onion crops and is transmitted by Thrips tabaci. Foliage damage of up to 75% has been reported in Kenya and Uganda. In this study, the rate of IYSV replication in the larva, pupa and adult stages of T. tabaci and other non‐vector thrips species and colour forms such as Frankliniella occidentalis, F. schultzei (dark) and F. schultzei (pale) was evaluated by monitoring relative levels of nucleocapsid (N) and non‐structural (NSs) proteins using N‐ and NSs‐specific antibodies. The effect of IYSV replication on mortality of thrips was also determined. N protein levels increased in all three stages of IYSV‐fed T. tabaci, indicating replication of IYSV. In IYSV‐fed non‐vector thrips, the increase of N protein levels in the larval stage was lower than IYSV‐fed T. tabaci but higher than their healthy counterparts. The N protein levels did not increase at pupal and adult stages. NSs protein was not detected in first instar of either vector or non‐vector thrips species. After a 4 h post‐acquisition period, a significant increase in NSs proteins was only observed in IYSV‐fed T. tabaci, clearly differentiating vectors and non‐vectors of IYSV. IYSV replication did not influence the survival of the vector thrips species, T. tabaci populations or the non‐vector thrips species. This study indicates the effectiveness of monitoring non‐structural proteins such as NSs, compared to nucleocapsid proteins, for differentiating vectors and non‐vectors of IYSV.     

甜瓜黄斑病毒三亚分离物S RNA的分子特征

 甜瓜黄斑病毒（Melon yellow spot virus, MYSV）首次发生于日本,造成甜瓜和黄瓜的严重损失,Kato等系统地研究了病毒的传播方式、寄主范围、超微结构和基因组特征,认为MYSV应为番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的1个新种［1,2］。2006年以来,台湾的西瓜［3］和黄瓜［4］上相继发现MYSV。2009年春季,古勤生在海南三亚的保护地甜瓜上发现一种新发生的病毒病,发病率30%~100%,病株出现系统性黄化坏死斑点,为MYSV侵染的典型症状,结合分子检测结果判定病原为MYSV。     

广东西瓜上检测到甜瓜黄斑病毒

在广东发现了可能被番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒侵染的西瓜,采用ELISA和RT-PCR法对该西瓜病样进行了检测,西瓜病叶粗汁液不与番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和西瓜银斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus,WSMoV)的血清发生反应;利用引物J13/UHP通过RT-PCR可以扩增出约1400 bp的基因片段,该片段包括一个840 bp的核衣壳蛋白ORF,其推导的氨基酸序列与已报道的Melon yellow spot virus(MYSV)NP基因氨基酸序列的同源率都为99%,进化树分析表明侵染广东西瓜的病毒(命名为MYSV-GZ)属于Tospovirus的MYSV血清组。     

利用实时荧光RT-PCR方法检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒

根据番茄环斑病毒和烟草环斑病毒各分离物CP基因的保守序列分别设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,分别建立了ToRSV和TRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,在口岸病害检疫中具有广泛的应用前景。     

小麦矮缩病毒NASH快速检测方法的建立及应用

以非放射性物质地高辛为标记物,采用PCR法制备了特异性强、灵敏度高的DNA探针。通过优化反应体系,建立了小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)的核酸斑点杂交(nucleic acid spot hybridization,NASH)快速检测技术体系。该方法诊断准确率高,操作简单,周期短,整个检测过程仅需5h左右。利用建立的NASH技术开展WDV流行学调查,发现近年来WDV在我国陕西韩城、山西太原和河北石家庄等地区点片发生,没有大面积暴发成灾。