棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化

从棉花叶组织中分离到的类芽孢杆菌(Paenibacillus)LC105菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有明显的拮抗作用.该菌株发酵液分别用过滤、高压灭菌及有机溶剂处理,初步证明对大丽轮枝菌产生拮抗作用的物质为蛋白质.LC105菌株发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephacryl S-100凝胶层析分离纯化,得到了分子量为27 kDa的抗菌蛋白.     

一株棉花黄萎病拮抗芽孢细菌的分离鉴定及活性检测

 采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,得到一株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有较强的抑菌活性的拮抗细菌Z-5菌株。通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析,确定拮抗细菌Z-5菌株为Bacillus malacitensis。盆栽实验表明Z-5菌株对大丽轮枝菌的防治效果达到76.05%,对棉花黄萎病具有明显的防治作用。     

棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根内的定殖

通过盆栽试验,对棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根际、根内的定殖情况进行了分析。结果表明,在自然条件下,拮抗细菌DS45-2菌株能够在土壤及棉花根际、根内定殖。拮抗菌株DS45-2施到土壤中后的45d内,其定殖数量在开始25d内显著下降,但随后下降缓慢并逐渐趋于稳定,维持在106个·g-1土左右。接菌后45d,DS45-2在棉花根内的定殖菌量达2.35×104个·g-1根,在棉花根际的定殖菌量达97.4×106个·g-1土,且重新分离出的拮抗菌株保持较高的拮抗活性。DS45-2菌株在灭菌土中的定殖数量高于自然土中的数量。随土层深度的增加,定殖菌量呈下降趋势,但变化不明显。     

棉花抗黄萎病QTL定位研究进展

QTL(quantitative trait locus)定位将控制数量性状的基因分解成单个孟德尔因子进行详细剖析,更为细致地了解数量性状的遗传规律,为加速棉花抗黄萎病的遗传改良奠定基础。本文概述了棉花抗黄萎病QTL定位理论和现状,讨论了棉花抗黄萎病QTL定位过程中存在的问题及在遗传改良上的应用前景。     

一个棉花黄萎病抗菌肽基因25a2的克隆与表达

 将棉花黄萎病抗菌肽A2的N端15个氨基酸序列在NCBI进行同源序列比较,根据同源蛋白的DNA序列设计引物,以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）RS-25菌株基因组为模板,应用PCR扩增出一条约300 bp的DNA片段。序列分析表明,DNA片段长354 bp,编码117个氨基酸,将该基因命名为25a2。构建表达载体pET-28a-25a2,转化大肠杆菌（Eschrichia coli）BL21,37℃培养,应用终浓度为1 mmol·L^-1的IPTG诱导,表达产物经SDS PAGE分析,得到分子量约15 kDa表达蛋白条带,与理论蛋白分子量相符。     

不同抗性品种对棉花黄萎病菌致病力的影响

 以1个海岛棉品种和15个陆地棉品种为分离寄主,采取单孢分离,共分离出67个黄萎病菌系。以抗性差异较大的海岛棉品种Pima90-53和陆地棉品种冀棉20、邯208和中棉所8号为鉴别寄主,采用苗期营养钵定量注菌液法对分离菌系进行了致病力鉴定。结果表明,同一地块田间不同品种所分离菌系的致病力类型并非单一类型,而是由致病力连续变化的多种致病力菌系类型组成;由不同品种分离出的菌系致病力存在差异,寄主品种的抗性与分离的黄萎病菌系的致病力无关,但不同基因型品种可能会影响不同致病力菌落的消长。     

拮抗细菌C-02防治棉花黄萎病的机理研究

 从抗生、竞争和诱导系统抗性三个方面对拮抗细菌C-02防治棉花黄萎病的机理展开了研究,结果表明,C-02分泌的抗菌蛋白能溶解病原菌VD-11的细胞壁,抑制其致萎毒素的分泌。与病原菌VD-11相比,C-02利用碳源有明显优势,在棉花根际土壤中具有显著的营养竞争优势和很好的定殖能力。C-02处理棉苗后,棉叶中植株防御性酶系PAL、POD和PPO的活性提高幅度大,维持时间长。C-02防治棉花黄萎病的机理是抗生、溶菌、竞争和诱导棉苗系统抗性的综合表现。     

木霉菌对棉花黄萎病菌拮抗的作用

以绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)，以及二株未知种名的木霉菌株(Trichoderma spp.)为供试菌，采用对峙培养测定其对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)的抑制作用，并研究了四种木霉菌产生的非挥发性代谢物对菌丝干重的影响。结果表明：在对峙培养中，木霉菌对棉花黄萎病菌均有明显抑制作用，木霉菌产生的非挥发性代谢物可以强烈抑制棉花黄萎病菌生长，明显降低其菌丝干重，并具有热稳定性。光学显微镜下观察，木霉菌丝在棉花黄萎病菌丝上平行或波浪式生长且棉花黄萎病菌丝出现细胞原生质浓缩和菌丝断裂等现象。     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及其表型分析

 以棉花强致病力黄萎病菌株V592为材料,利用农杆菌介导的T-DNA插入技术构建了一个含15000个转化子的突变体库,对突变体的生物学特性、致病力及T-DNA插入拷贝数进行研究,结果显示：(1) 突变体的菌落形态分为菌核型、中间型、菌丝型和菌膜型,分别占92.12%,4.54%,3.19%和0.15%;（2）菌核型、中间型和菌丝型菌株,在菌落生长速度和孢子大小方面无明显差异;而在产孢量方面,菌核型普遍强于中间型和菌丝型;（3）致病性测定显示,菌核型的致病力普遍强于中间型和菌丝型;（4）Southern杂交显示,T-DNA单拷贝数插入的突变体比率约为70.99%,而菌核型的单插入率为80.00%,明显高于中间型(69.23%)和菌丝型(64.71%)。以上结果表明,农杆菌介导转化技术可用于棉花黄萎病菌突变体库的快速构建,突变体的菌落表型与其产孢能力、致病力及T-DNA插入拷贝数等之间存在一定的相关性。     

接种不同致病力黄萎病菌的F1代棉花的基因型抗性研究

 在乌兹别克斯坦,棉黄萎病对棉花造成严重损失。为了选育能抗强致病力菌系的棉花品种,需确定棉花对不同地域的强致病力菌系的基因型抗性和F₁代的抗性遗传度。研究发现,品种Omad和品系L-44,L-408,L-155,L-1708对所选菌系的抗性最好。当受到侵染时,它们表现出超敏感性,但不表现黄萎病症状。F₁代的黄萎病抗性为超显性和显性遗传,且与鉴定方法无关。同时,存在中间性遗传。遗传优势度取决于其亲本的配合力、F₁代受侵染时的基因反应型和不同地域菌系的致病力。其中,Omad,С-5621,L-44,L-1708的表型抗性高;在F₁代中,组合L-155×С-5621和L1708×С-5621的表型抗性较高,在50％～80％。黄萎病抗性遗传控制的特点是趋向于最好或最差亲本的负或正的超显性、显性遗传以及中间型遗传。对所选菌系,杂交组合L-155×С-5621 和 L-155×L-44的综合抗性最好。     

Isolation and Characterization of Endophytic Bacillus methylotrophicus LH-L3 Antagonist of Cotton Verticillium Wilt

The aim of this study is to obtain endophytic Bacillus with control effect on cotton Verticillium wilt. [Method] The cotton tissue grinding liquid was heated at 80 ℃, and spread onto the Luria-Bertani ager medium. The strains with better inhibitory effects on Verticillium dahliae Vd084, a strain with strong pathogenicity, was identified by the morphology, physiological and biochemical traits as well as 16S rRNA, gyrB and rpoB sequences, and its control effect on cotton Verticillium wilt was determined by pot experiments. [Result] 61 similar Bacillus strains were isolated from cotton plants. Among them, 17 strains could inhibit Verticillium dahliae Vd084. A strain named LH-L3 with a relatively higher antagonistic activity and a broad inhibition spectrum was obtained in the second screening. LH-L3 was classified into Bacillus methylotrophicus. Compared with the control, the emergence rate, plant height, root length, fresh weight of aerial part and underground part of cotton with 106 mL^－1 LH-L3 suspension drenching for 3 times increased by 42.85%, 10.24%, 23.83%, 10.05% and 97.62%, respectively. And control effect on Verticillium wilt was 85.24%. [Conclusion] LH-L3 had good growth promotion and Verticillium wilt control effects and showed good potential for biological control.     

缩节安对棉花黄萎病发生发展的影响

在棉花黄萎病（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ）发病初期田间用缩节安叶面喷施的方法处理棉株可减轻黄萎病的叶面症状,控制该病的发生扩展;在重病田以２０、４０、６０ｍｇ·ｋｇ－１的浓度于７月上旬,在河南新乡叶面喷施１～２次,病指相对减退率为４４．７％～６６．７％,产量增加０．８６％～９．５９％。     

利用拮抗真菌防治棉花黄萎病

从分离和征集的土壤真菌中筛选出13个对黄萎病菌有生防潜力的菌株。温室盆栽试验表明,这13个菌株均可有效地降低棉黄萎病的发生率和病情指数,其中以菌株T3 4(Trichodermasp.)、THT(T.hamatum)和T2 4(T.sp.)作用效果最为明显。田间小区防效试验表明,3个木霉菌株对棉黄萎病第一次发病高峰和第二次发病高峰的防治效果达到38.2%～53.5%和13.6%～36.0%。     

棉花黄萎病研究进展

由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病已成为当前我国棉花可持续生产的主要障碍之一。该病害为土传种传维管束病害,具有病原菌寄主范围广,防治困难的特点。本文综述了近年来国内外有关其病原菌的致病力分化、全基因组测序与致病机制、微菌核形成与萌发机制,寄主的抗病分子机制以及病害防治措施等方面的最新研究进展。     

我国棉花黄萎病菌的群体遗传

从 1 2 6条随机引物中筛选出 9条能产生多态性好、条带稳定的引物。用这 9条引物对来自我国主产棉区河北、河南、江苏、山东 4个群体的 9个亚群体 1 1 7个菌株进行 RAPD扩增。对各个群体、亚群体的群体遗传结构分析表明 ,各省群体遗传相似性较高 ,总的遗传变异量为 0 .0 947,其中72 .5%由群体内的变异引起 ,1 2 .5%由省内群体间引起 ,1 5%由群体间的变异引起 ;群体间的基因流动值为 2 .83 ,群体间、亚群体间均存在较高的基因流动 ;落叶型特征条带在各个亚群体内出现频率均很高 ,表明棉花黄萎病菌落叶型菌株在我国主产棉区的河北、河南、山东、江苏 4省棉区分布广泛 ,并已成为或正在成为优势种群     

Development of a Biological Complex Seed-Coating Agent to Control Verticillium Wilt

[Objective] The aim of this study is to make use of the antagonism and growth promoting ability of Bacillus methylophicus strain LH-L3, and add it into the chemical seed-coating agent as an active ingredient. [Method] The optimum formula (agent No.4: 2.5% fludioxonil＋10% thiram＋10% carbofuran＋109 cfu·mL^－1 LH-L3) was obtained based on the sterilization effect of four seed coating agents on infected seed. Then the survival ability of the strain in agent No.4 and its shelf life were identified by plate test. Finally, the disease and pest control effects were tested in the greenhouse pot experiment. [Result] The results showed that the agent No. 4 had the best control effect, and 1.1×105 cfu·mL^－1 of LH-L3 after storage at room temperature for 6 months. Compared with the control, the formula No. 4 increased 11.54% emergence rate, 18.74% plant type height and 20.91% leaf width, respectively, in the 15th day after emergence, and decreased 65.42% and 48.56% of Verticillium wilt at day 2 and day 5 after the disease occurred. The cotton seeds coated with formula No. 4 reduced 83.07% of plant and 92.33% of leaf damaged by Sylepta derogata, compared with the negative control without seed coating. [Conclusion] Strain LH-L3 and chemical pesticide compound as a seed coat agent is completely feasible. And the developed biological complex seed-coating agent has better control effect on Verticillium wilt and Sylepta derogate.     

棉花抗黄萎病相关基因的序列和表达分析

黄萎病是棉花生产的主要病害,克隆抗病基因是培育棉花抗黄萎病品种的关键。本文根据前期的定位结果,结合棉花基因组测序信息,提取定位区段内基因组序列,预测获得63个基因。Gene Ontology分析表明63个基因参加多种生物进程,其中6个基因参与植物抗逆进程。根据Gene Ontology分析和前人研究结果,选择15个基因进行序列分析。启动子序列分析表明启动子区域包含各种抗逆的调控元件,其中6个基因包含了W-box元件。对海7124和苏棉8号棉花幼苗进行黄萎病菌处理,取病菌处理后不同时期的根,选择14个基因进行表达分析,结果表明在黄萎病菌处理后,有8个基因表达出现变化,其中在海7124和苏棉8号之间表达差异最大的基因是跨膜蛋白(Transmembrane protein 214-a isoform 1)、细胞色素P450(Cytochrome p450)和Udp-糖基转移酶UGT89A2(Udp-glycosyl transferase 89a2-like)基因。本研究为抗病基因克隆提供了候选基因。     

相对病情指数划分棉花品种抗病性的统计学基础

对多年棉花品种的黄萎病抗病性鉴定资料分析表明,同一个品种的黄萎病病情指数年度间差异变化较大。8年的鉴定资料统计结果表明,中棉所12的病情指数年度间变异系数为37.4％,冀棉11为33.3％,方差分析表明它们的病情指数年度间变异极显著。对1992—1997年中棉所12的病情指数进行概率统计,其总体平均数的估计值为62.0,95％置信区间为[58.4,65.6];99％置信区间为[57.2,66.8]。利用本文方法计算的相对病情指数来表示棉花品种的黄萎病感病性,与利用病情指数表示方法相比,可以将年度间变异降低60％,发生概率p=0.997。本方法划分的抗病性不同于目前通用的以一个年度田间病情指数划分的品种抗病性,而是概率保证下的抗病性,具有深层的数理统计的意义。