尖峰岭抗逆性根瘤菌的筛选及其16SrDNA序列的测定

为了探讨木本豆科植物根瘤菌对不良环境的抵抗能力,对分离自海南尖峰岭国家自然保护区的9株根瘤菌进行了初步研究。结果发现:9株根瘤菌最适生长pH值均为7,最适NaCl含量均为10.0 g·kg^-1;菌株CAF224的最适生长温度为37 ℃,菌株CAF416、CAF438和CAF279的最适温度为20 - 28 ℃,其余5株为28 ℃。9株根瘤菌均可在pH值4 - 11、NaCl 20.0 g·kg^-1 、37 ℃条件下生长,其中CAF224和CAF276菌株耐受pH值3; CAF226可以在40.0 g·kg^-1 NaCl培养基中生长;CAF276可耐受20 min 50 ℃、10 min 60 ℃高温。不同宿主、不同生态条件下的根瘤菌株具有不同的抗逆性,通过综合分析,筛选出4株高抗菌株(CAF226、CAF276、CAF224、CAF414)。16S rDNA序列系统发育分析表明:9菌株在系统进化树上与GenBank中序列号为EF054889的Rhizobium tropici Clone H12(热带根瘤菌)聚为一族,相似度为99.4%,初步确定9株根瘤菌为热带根瘤菌。     

具有解磷能力的相思根瘤菌的筛选

对海南、福建、广州、清新分离的根瘤菌和实验室保存的部分根瘤菌进行了解磷能力的研究,从200多株根瘤菌中筛选出40株具有解磷能力的菌株,通过测定根瘤菌在固体培养基和液体培养基中溶解无机磷和有机磷的能力,筛选出2株解磷能力较强的菌株G7-3和菌株DH001.菌株G7-3在无机磷和有机磷培养基中的解磷量分别是4.142、9.944 μg·mL-1,与其它菌株有明显的差异;在无机磷液体培养基中,菌株DH001微克菌体解磷量为0.086 7 μg,和其它菌株有显著差异.对筛选出的菌株进行了16S rDNA测序分析,确定筛选出的菌株除H1-1-1和H2-1-2外,其它菌株均为根瘤菌.     

木本豆科植物根瘤菌16S rDNA的PCR-RFLP研究

为了研究华东地区木本豆科植物根瘤菌种质资源的遗传多样性,采用6种限制性内切酶对53株根瘤菌进行16S rDNAPCR-RFLP多态性分析,共产生35种类型的16S rDNA遗传图谱.聚类分析结果表明,在75%的相似水平上,所有供试菌株可以分为8个系统发育分支.其中,分支3由22个菌株组成,属于中慢生根瘤菌属(Meso-rhizobiura);9个菌株组成分支6和7,属于快生根瘤菌属(Rhizobium);分支5包含7个菌株,属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium);其余19个菌株与已知菌株亲缘关系较远,可分为4个未知的系统发育分支,这4个新的分支最少有1个新的根瘤菌属存在.结果还表明木本植物根瘤菌存在着极丰富的遗传多样性.     

一株拮抗树木褐根病菌的伯克霍尔德菌的分离及鉴定

树木褐根病是由有害木层孔菌(Phellinus noxius)引起的一类土壤传染性根部病害,为了实施对这类病害的生物防治,结合唯一氮源1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)为底物和平板对峙法,从澳门松山市政公园健康树木的根际分离得到1株对有害木层孔菌具有较强拮抗活性的菌株1583.采用一对细菌通用引物PCR扩增获得菌株1583的16S rDNA基因序列,其片段大小为1 496 bp,系统进化树显示菌株1583与Burkholderia seminalis的亲缘关系最近,综合结果鉴定该菌株为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.).拮抗性研究表明,菌株1583对油菜菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黑松叶斑病病原菌(Pestalotiopsis sp.)、香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)、白蝴蝶炭疽病病原菌(Colletotrichum sp.)和美人蕉瘟病病原菌(Pyricularia cannaecola hashioka)等植物病原真菌均有明显的抑制作用.     

林下姜科植物的选育与栽培技术研究综述

树木褐根病是由有害木层孔菌 (Phellinus noxius) 引起的一类土壤传染性根部病害，为了实施对 这类病害的生物防治，结合唯一氮源 1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸（ACC）为底物和平板对峙法，从澳门松山市 政公园健康树木的根际分离得到 1 株对有害木层孔菌具有较强拮抗活性的菌株 1583。采用一对细菌通用 引物 PCR 扩增获得菌株 1583 的 16S rDNA 基因序列，其片段大小为 1 496 bp，系统进化树显示菌株 1583 与 Burkholderia seminalis 的亲缘关系最近，综合结果鉴定该菌株为伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.）。拮抗 性研究表明，菌株 1583 对油菜菌核病病原菌（Sclerotinia sclerotiorum）、黑松叶斑病病原菌（Pestalotiopsis sp.）、香蕉枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）、白蝴蝶炭疽病病原菌（Colletotrichum sp.） 和美人蕉瘟病病原菌（Pyricularia cannaecola hashioka）等植物病原真菌均有明显的抑制作用。     

樟子松固沙林土壤可培养固氮细菌的群落结构

为探明樟子松固沙林土壤中可培养固氮细菌的种类及其能力,丰富植物促生细菌菌种库,以传统纯培养方法筛选获得固氮菌株,基于16S rRNA基因,对其进行系统发育分析,并以靛酚蓝-分光光度法和钼锑抗比色法对所得菌株进行产氨和溶磷能力分析。结果表明,分离获得的12株固氮细菌以变形菌门、放线菌门和厚壁菌门3个门,6个科,7个属组成。变形菌门(50.0%)为优势门,Oxalobacteraceae(33.3%)和Microbacteriaceae(33.3%)为优势科,Curtobacterium(33.3%)为优势属。菌株的产氨能力在0.118～1.639 mg·L~(-1)之间,15-17、56-2、15-8和42-4菌株具有较强产氨能力,分别为1.639 mg·L~(-1)、1.470 mg·L~(-1)、1.301 mg·L~(-1)和1.132 mg·L~(-1);有7株固氮细菌具有溶磷能力,36-5和30-3菌株均具有较强溶磷能力,分别为32.24 mg·L~(-1)和37.63 mg·L~(-1)。樟子松固沙林土壤蕴藏有多种固氮细菌,均有产氨能力且多数兼具溶磷能力,可作为植物生长促生细菌的重要来源。     

杂交相思根瘤菌的抗逆特性

对20个分离自广西不同地方的杂交相思根瘤菌菌株进行温度、pH值、NaCl及抗生素的抗逆性研究。结果表明,65％的菌株能在39℃时生长良好;100％的菌株能在pH值5．0—9．0的条件下生长良好;所有菌株在2．0％浓度NaCl下均不能生长,有5个菌株在1．5％浓度下能生长。菌株对不同抗生素表现出不同的抗性,有16个菌株对Tc有抗性,仅有2个菌株对Km有抗性。不同的菌株对抗生素表现出不同的抗性,Z’2-7抗性最强,而L1-6、12—7、L3—2、S＇3--6抗性最差。     

香石竹ACC氧化酶重复基因植物表达载体的构建及转基因植株的获得

香石竹ACC氧化酶基因从核NDA中克隆之后,将其首先构建成正义及反义的单拷贝植物表达载体,在此基础上又同向插入一个ACO基因片段,从而获得ACO的正义重复基因和反义重复基因植物表达载体,所得载体已通过酶切分析和PCR鉴定。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404菌株,并转化香石竹品种Master、爱卡迪幼叶,经PCR检测和Southem杂交鉴定,获得了8株转化植珠。     

黑木相思根瘤菌在厚荚相思苗木上的效应

为了探讨不同相思树种根瘤菌互接种的效应,将黑木相思根瘤菌接种到厚荚相思苗木上,采用随机区组盆栽试验方法,研究苗木的结瘤、生长和固氮能力.结果表明:接种黑木相思根瘤菌能明显增加厚荚相思苗木的结瘤,证明不同相思树种之间,其共生的根瘤菌对宿主的要求并不十分的严格;但是,不同菌株对苗木的生长效应和固氮能力上存在明显的差别.因此,在开发根瘤菌资源时,应充分注意树种与菌株的匹配问题,在考察相思树种根瘤菌是否优良时,要综合考虑其侵染结瘤特性、对苗木生长的促进作用以及菌株的固氮酶活性及固氮量等因素.     

油茶根际高效溶磷细菌的筛选、鉴定及其安全性测试

本研究利用溶磷圈法和钼锑抗比色法,从油茶根际分离出20株高效溶无机磷细菌,并对其溶磷能力进行定性和定量测试,结果发现,D/d与溶磷细菌的有效磷含量之间没有显著的相关性,而培养液p H与有效磷含量之间存在极显著的负相关性关系(P<0.01)。并采用形态特征、生理生化、Biolog系统和16Sr DNA序列分析对一株溶磷效果最好的菌株NC285进行菌株鉴定,确定其为Bacillus aryabhattai。通过苜蓿植物模型和cbl A毒力基因测定对该菌株进行安全性检测,结果发现,该菌株未检测到cbl A基因,对洋葱和苜蓿安全无致病性。本研究对溶磷细菌的安全应用及提高油茶土壤磷素利用效率具有重要意义。     

广东箣竹内生固氮菌生理特性及促生效果研究

从广东箣竹中分离、筛选得到5株固氮酶活性高且稳定、生长势强的内生固氮菌株,对其生理特性、环境适应性及其对植物的促生效果进行了系统研究.结果表明:在无氮培养、温度18～40 ℃时,菌株均能生长且有固氮酶活性,其最适生长及固氮的温度为26～37 ℃;在偏酸(pH值5.0)和偏碱(pH值8.0)的条件下,菌株均能保持较强的生长势和较高的固氮酶活性,并能通过调节自身代谢适应环境的酸、碱变化,使培养液趋近中性;培养液中NaCl浓度在0.5～2.5 g·L-1、(NH4)2SO4浓度在0.05～0.50 g·L-1时,菌株均能保持旺盛生长且有较高的固氮酶活性.接种水稻试验表明:菌株对植物的生长有一定的促进作用.     

不同种源刺槐根瘤菌抗逆性研究

对河北省栽植的不同种源刺槐（Robinia pseudoacacia）根瘤进行了的分离，获得57株根瘤菌，并对其中酶切有差异的30株进行耐酸碱、耐盐、耐高低温及耐抗生素的抗逆性指标试验。结果表明，刺槐根瘤菌对环境具有较强的适应性：23．3％株刺槐根瘤菌能在5％盐浓度的YMA培养基上生长，83．3％株刺槐根瘤菌能在pH值12．0的碱性YMA培养基上生长，66．7％株刺槐根瘤菌能在37℃下生长，56．7％的刺槐根瘤菌对50μg／mL的氨苄青霉素有抗性。试验筛选出了11株耐酸碱能力较强的刺槐根瘤菌他们均能耐受盐浓度为4％的盐环境和pH值为12．0的碱性环境。这些抗逆性强的菌株为改善盐碱地的刺槐健康生长提供了科学依据。     

基于ITS序列对两株野生大型真菌的鉴定及系统发育分析

采用传统形态学分类法与 ITS（Internal transcribed spacer）序列分析法对采自湖北省恩施地区的2株野生真菌（样本编号: HBES1003、HBES1096)）进行分类鉴定与系统发育分析。依据其形态特征初步鉴定该2株菌株为绒盖牛肝菌属 (Xerocomus)菌种。为进一步确定鉴定的准确性和科学性学,对2株菌株样本的ITS全区序列进行PCR扩增测序,并在NCBI数据库中进行Blast比对,采用 NJ(Neighbor-Joining)邻接法构建出系统发育树,通过探究其与已知菌种的相关性进行分析鉴定。结果表明:样本HBES1003为绒盖条孢牛肝菌Xerocomus subtomentosus,样本HBES1096为黑斑绒盖牛肝菌Xerocomus nigromaculatus。     

不同长度ThVHAc1基因启动子片段分离及活性分析

[目的]VHAc基因(V-ATPase c亚基)是V-ATPase的重要亚基,能响应盐、重金属等胁迫,过表达刚毛柽柳ThVHAc1基因的酵母能提高抗CdCl_2耐NaCl能力。本研究拟通过分离ThVHAc1基因不同长度启动子片段并对其胁迫后活性进行分析,以进一步探讨ThVHAc1基因响应CdCl_2和NaCl胁迫的机制。[方法]根据ThVHAc1基因启动子中含有的Dof顺式作用元件的分布,将ThVHAc1基因上游启动子分为205 bp(-1—-205),504 bp(-1—-504)和781 bp(-1—-781)3个不同长度片段。将这些不同长度启动子片段分别替换p CAMBIA1301载体上的CaMV35S启动子,以驱动GUS基因表达,构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥。对4周龄的T4代转基因拟南芥分别进行H_2O(非胁迫处理,对照)、100 mmol·L~(-1)NaCl和150μmol·L~(-1)CdCl_2胁迫处理,比较不同转基因株系的GUS染色和GUS酶活性。[结果]正常生长条件下,CaMV35S株系在根、茎、叶中均有GUS染色;3个启动子片段转基因株系均能在不同组织观察到GUS染色,且在根、茎、叶中有一定差异,但整体上GUS酶活性表现为781504205。NaCl胁迫下,CaMV35S株系的GUS染色及酶活性与正常生长条件相比无明显变化,但3个启动子片段转基因株系的GUS染色及酶活性均显著降低,且781株系的GUS酶活性分别为205和504株系的2.73和2.07倍;同时,3个启动子片段转基因株系的组织表达特性发生了一些改变,如,504株系在老叶中表达明显增强,嫩叶中减弱,根中无明显变化。CdCl_2胁迫下各转基因株系的GUS染色和酶活性变化趋势与NaCl胁迫相似。CdCl_2胁迫下,205,504,781株系的GUS酶活性分别为非胁迫时的52.4%,57.9%和80.9%;胁迫后的组织表达活性也发生了一些改变,205株系的GUS染色在老叶较深、嫩叶较浅,504株系则在各部分的表达较均匀,781株系大多叶片的GUS表达减弱;但781株系的GUS酶活性仍然最高,分别为205和504株系的2.67和2.07倍。[结论]ThVHAc1基因启动子片段的驱动活性与长度呈正相关;各不同片段启动子在根、茎、叶中的GUS染色及活性具有一定差异,体现在不同启动子片段的表达活性具有一定的组织特异性。NaCl和CdCl_2胁迫对ThVHAc1基因启动子的驱动能力具有一定影响,胁迫后各启动子片段转基因株系GUS酶活性均显著降低,但长片段受胁迫的影响程度低于短片段。Dof元件的数量在3个启动子片段中依次减少,表明Dof元件可能对NaCl和CdCl_2胁迫有一定的调节作用。同时,NaCl和CdCl_2胁迫对ThVHAc1基因启动子的组织表达特性具有一定的影响。     

草木樨中华根瘤菌CHW10B溶磷特性及其对南方红豆杉的促生作用

[目的]探讨南方红豆杉根际微生物草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)CHW10B的溶磷特性及促生作用。[方法]利用液体发酵试验比较不同时间、碳源、氮源、碳氮比、培养温度等条件下CHW10B菌株的溶磷量,采用温室盆栽法研究该菌株对南方红豆杉生长的影响,并分析该菌株产嗜铁素、精氨酸脱羧酶、ACC脱氨酶及有机酸等成分的能力。[结果]该菌株分别在培养时间4 d、磷酸钙5.00 g·L~(-1)、初始p H值7.0、装液量1/2、NaCl为0.0 g·L~(-1)、温度30℃、碳源为葡萄糖、氮源为硫酸铵、碳氮比100∶1时溶磷能力最强。将该菌株接种于1年生南方红豆杉实生苗360 d后,苗木的地径、苗高、生物量比对照分别增长了19.53%、20.14%、25.39%。该菌株能够产嗜铁素、精氨酸脱羧酶、ACC脱氨酶(0.922 U·mg~(-1))和IAA(8.908 mg·m L~(-1)),并可分泌大量有机酸—葡萄糖酸(5 704.92μg·L~(-1))。[结论]草木樨中华根瘤菌CHW10B溶磷能力强,对南方红豆杉促生作用显著,适用于多种不同酸碱性土壤,可高效应用于南方红豆杉的人工栽培,具有被开发为生物肥料的潜力。     

杉木林土壤中固氮功能细菌的生长特性研究

[目的]研究固氮功能菌株的生长特性,探索适地适菌原则。[方法]本研究以103株固氮功能细菌为研究对象,以p H值及培养温度为考量指标,分别研究了8个温度梯度、10个p H值梯度对菌株生长的影响。[结果]表明:经检测,含有nif H基因的菌株有103株;菌株的最适生长条件为温度28℃、p H=7,各菌株的温度适宜生长区为20、28、37℃,大量菌株生长的适宜p H值为4、5、7、8;在低温、碱性土中的适用菌株为6003,在高温、碱性土中的适用菌株有09ul27、1010、2024、2029、7002、lk2-1c(2)和zk3-1,在酸性及碱性土中均适宜生长的菌株为1012和2025。根据菌群不同生长特性,对所有菌株进行非层次聚类,使用SSI算法得出最优分类为9类,其中,第5类和第7类全部属于伯克霍尔德属,第2类基本为芽孢杆菌属,其它类别中各菌属没有出现明显的聚类现象,且生长条件分类与菌种的初步鉴定分类没有明显的相关性。[结论]固氮功能菌株的适宜生长环境较一致,最适宜的生长条件为温度28℃、p H=7。筛选出适合在特殊环境生长的固氮功能细菌10株,各菌株初步鉴定为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、Chitinophaga pinensis、Burkholderia xenovorans、Burkholderia phymatum、Burkholderia bannensis。通过生长条件聚类分析及所有菌株的16S r DNA鉴定比对得出,菌株的生长特性与其生物学特征不完全相关。     

板栗根际高效解磷菌的筛选

【目的】从板栗根际分离筛选高效解磷微生物,研究解磷微生物对板栗生长的影响。【方法】选用磷酸钙作为培养基中唯一磷源,采用透明圈法结合钼蓝比色法筛选菌株,对所筛选菌株的解磷特性进行初步研究,并回接至盆栽板栗组培苗根际土壤,研究其促生作用。【结果】培养6 d后,共筛选得到具有解磷能力的菌株7株。对比各菌株的解磷能力,结果表明,菌株P6在以无机磷磷酸钙为磷源的培养基上溶磷指数为2.00,可溶磷含量达到75.98 mg/L,确定菌株P6为高效解磷菌。通过形态观察、生理生化特性检测及16S rDNA分子水平鉴定,确定菌株P6为洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia。以有机磷卵磷脂为磷源对菌株P6进行液体培养,溶液中可溶磷含量为40.30 mg/L,碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性比CK分别增加了16.62、24.61 mmol/(L·h)。盆栽回接试验结果表明,接种菌株P6后板栗株高、茎粗分别比CK增加了60.70%、21.67%,植物地上部分和地下部分含磷量分别比CK提高了53.41%、52.33%,土壤碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均显著增加,分别比CK增加了145.54%、449.27%,表明接种菌株P6对板栗解磷能力有明显的促进作用。【结论】菌株P6具有高效解磷能力,回接菌株P6能明显促进板栗组培苗的生长。     

相思根瘤菌耐酸性研究及耐酸菌株的筛选

对２２株相有瘤菌耐酸性的比较结果得出：大多数的相思根瘤菌不耐酸。在ｐＨ５．０条件下大多数根瘤菌生长不好,只有ＩＳ００４、ＩＳ００２、ＣＲ００２和ＬＲ００７菌株生长较好,在培养基ｐＨ３．８６条件下和在ｐＨ４．９土壤悬液中,ＩＳ００４和ＩＳ００２菌株的生长及存活率较其它菌株高,通过在酸性条件下生长与结瘤的试验,初步筛选出耐酸菌株ＩＳ００２。     

杉木炭疽病菌的分离鉴定和致病性分析

为明确引起尤溪县杉木炭疽病的病原菌种类,采用常规组织分离法对采自西城镇东村村杉木人工林的疑似炭疽病病样进行病原菌分离与培养,利用形态学观察和系统发育分析对获得的病原菌株进行鉴定,同时对病原菌进行活体条件下的致病性测定。结果表明：共分离获得5株病原菌,菌落形态相似,气生菌丝白色、絮状,分生孢子无色透明,呈圆柱状,两端钝圆。基于ITS和GAPDH基因构建系统发育树,菌株S1、S3、S5、S7、S9与沧源炭疽菌Colletotrichum cangyuanense均聚在同一分支。结合形态学特征、系统发育分析和柯赫氏法则验证结果,将尤溪县杉木炭疽病病原菌鉴定为沧源炭疽菌C. cangyuanense。     

广西红壤区林木根际溶磷菌的筛选与鉴定

南方速生丰产林多为人工纯林,生态系统薄弱,林地产出多,施用大量的化肥,造成林地生态环境恶化,速效磷已成为南方红壤区林木生长的主要限制因子之一,为了减少化肥的施用量,提高南方林木对土壤磷素的利用率,开发林木微生物肥料,利用以磷酸钙为磷源的难溶性无机盐培养基从南方不同红壤区林木根际土壤中筛选分离得到42株溶磷菌,获得其中6株高效菌株探讨其溶磷机理,并用测序技术进行菌株鉴定。结果表明:所筛选得到的6株D/d值大于1.2的菌株在液体发酵条件下均有明显的溶磷能力, L205菌株溶磷量最大达到203.04 mg·L~(-1)。各菌株在发酵过程中pH值不断降低,从6.50～6.78降低到3.13～4.12,与其溶磷量具有一定的相关性。通过16 S r DNA序列测序确定L205的系统发育地位,发现该菌株为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。L205菌株具有很好的溶无机磷效果,在南方林业生产实践中具有较好的应用潜力,同时也为南方速生丰产林的减肥增效扩宽了思路。