柔嫩艾美耳球虫孢子发育三种阶段的同工酶研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)未孢子化卵囊,孢子化卵囊、孢子囊的乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、6-磷酸萄萄糖酸脱氢酶(6PGD)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、碱性磷酸酶(ALP)和葡萄糖磷酸异构酶(GPI)等7种酶的同工酶,除IDH外,6种酶均显示出初步结果,孢子化卵囊和孢子囊6种酶的同工酶完全一致,未孢子化卵囊的LDH、G6PD、PGM、ALP、GPI 5种酶同工酶与孢子化卵囊、孢子囊一致,未孢子化卵囊的6PGD同工酶与孢子化卵囊、孢子囊呈现明显差异、讨论了球虫在孢子化过程中,一些酶的活性或同工酶发生变化的情况。     

3株柔嫩艾美耳球虫安徽株的同工酶检测

为了检测安徽3株柔嫩艾美耳球虫的耐药情况,采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳,进行了乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖磷酸异构酶(GPI)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)等同工酶酶谱分析,并与敏感株和参考耐药株进行比对。试验结果显示,敏感株与地方株之间的3种同工酶酶谱存在差异,敏感株间无差异,耐药株间有差异,同时各酶的结果也不一致。说明在建立参考株与单一药物耐药株同工酶酶谱的情况下,可以用同工酶检测法对球虫进行耐药性检测。     

柔嫩艾美耳球虫耐药株与鸡3种球虫的同工酶的研究

对不同离子载体抗生素具有抗药性的柔嫩艾美耳球虫和药物敏感的柔嫩区美耳球虫、布氏匀美耳球虫和堆型艾耳球虫的孢子化卵囊,采用聚安凝胶垂直板电泳,进行了乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）、葡萄糖磷酸异构酶（ＧＰＩ）和葡萄糖－６－磷酸脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）等同工酶华不同离子载体抗生素具有抗药性的柔嫩艾美耳球虫和药物同工酶酶谱可以反应出球虫种间差异;而柔嫩艾耳球虫抗性虫株的ＬＤＨ酶谱是２条带,敏感虫株是３条带,抗性株比敏感株     

五种鸡球虫卵囊的同工酶研究

采用聚丙烯酰胺凝胶管状电泳，研究柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、变位艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫卵囊的乳酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、葡萄糖－６－磷酸脱氢酶、碱性磷酸酶、６－磷酸葡萄糖酸脱氢酶的同工酶。结果显示５种球虫卵囊的５种同工酶酶谱能反映出虫种差异。作者认为同工酶技术有助于球虫种的分类。     

巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)地理株研究Ⅲ.11株巨型艾美耳球虫的同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳(PAGE)技术,对11株Ei meria maxima和1株E.tenella的孢子化卵囊,进行了乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖磷酸异构酶(GPI)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、葡萄糖磷酸变位酶(PGM)和苹果酸脱氢酶(MDH)的同工酶分析。试验结果显示,E.maxima和E.tenella在LDH、GPI、G6PD、PGM和MDH的酶谱上有明显差异,而在11株E.maxima之间无差异,表明E.maxima的酶变异相当保守。     

GSN0对E.tenella内LDH、G-6-PD、ACO和SOD活性的影响

亚硝基谷胱甘肽(GSNO)对鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)卵囊的孢子生殖具有不可逆地抑制作用,但其作用机理尚不清楚.本研究采用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析GSNO对E.tenella卵囊内与糖代谢有关的乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)、乌头酸酶(ACO)以及GSNO对卵囊内与抗氧化有关的超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响,电泳后经特异染色显示酶活性.结果表明:GSNO处理的未孢子化与孢子化卵囊中均有LDH、G-6-PD、ACO及SOD活性,这提示外源性NO对球虫孢子生殖的抑制并没有灭活卵囊中LDH、G-6-PD、ACO和SOD的活性或NO对这些酶的作用是可逆的.     

GSNO对E．tenella内LDH、G-6-PD、ACO和SOD活性的影响

亚硝基谷胱甘肽（GSNO）对鸡柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）卵囊的孢子生殖具有不可逆地抑制作用，但其作用机理尚不清楚。本研究采用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析GSNO对E．tenella卵囊内与糖代谢有关的乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖．6．磷酸脱氢酶（G．6．PD）、乌头酸酶（ACO）以及GSNO对卵囊内与抗氧化有关的超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响，电泳后经特异染色显示酶活性。结果表明：GSNO处理的未孢子化与孢子化卵囊中均有LDH、（3-6．PD、ACO及SOD活性，这提示外源性NO对球虫孢子生殖的抑制并没有灭活卵囊中LDH、G．6．PD、ACO和SOD的活性或NO对这些酶的作用是可逆的。     

斯氏艾美耳球虫ADF基因部分序列的克隆与分析

为了获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因并分析其与柔嫩艾美耳球虫长春株相应序列的同源性,试验根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因部分序列,然后将其克隆到pMD18-T载体中,应用DNAStar软件对测得序列进行序列分析。结果表明:斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因大小为357 bp;经DNAStar分析,我国斯氏艾美耳球虫长春株与柔嫩艾美耳球虫长春株ADF核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99.2%。说明ADF基因在进化过程中高度保守。     

旋毛虫同工酶初步研究

本文用薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦同工酶分析技术,比较了湖北、河南两地旋毛虫.结果表明,它们在葡萄糖磷酸异构酶(GPI)酶谱上存在差异.其中,湖北虫有三条带,位置靠前,而河南虫只有一条带,位置靠后.都不同于鼠肌肉酶条带.提示,来自不同地域的旋毛虫可能存在着虫株的差异,国内至今尚未见报道.作者认为,同工酶分析不仅为旋毛虫分类提供可靠依据,而且可为旋毛虫诊断防治提供参考.     

柔嫩艾美耳球虫河北株致病性检测及ITS-1基因序列分析

为分析鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)河北株的致病性及其ITS-1基因序列遗传变异特点,对临床分离的柔嫩艾美耳球虫河北株通过人工感染雏鸡试验验证其致病性,并计算其半数致死量(LD_(50)),采用RT-PCR对柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因进行扩增、克隆,测序后进行生物信息学分析其基因序列变异情况。结果显示:柔嫩艾美耳球虫河北株对雏鸡有较强的致病性,其LD_(50)为3.16×10~4个/只;柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因与GenBank登录的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株和柔嫩艾美耳球虫上海株的相似性在97.7%～99.0%之间,系统发育进化树分析显示柔嫩艾美耳球虫河北株与GenBank发表的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株和柔嫩艾美耳球虫上海株聚为一支,亲缘性最近,与其它虫株亲缘性较远;与GenBank发表的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株序列相比,柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因序列中在第4、13、16、425位4个碱基发生缺失;第258、348位2个碱基发生变异,由C变为T,由G变为T。研究结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫河北株遗传变异情况提供参考依据。     

绦虫类细胞遗传学研究——Ⅱ、细颈囊尾蚴三种同工酶电泳分析

本文应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了细颈囊尾蚴囊液的乳酸脱氢酶(LDH),苹果酸脱氢酶(MDH)和酯酶(Est)三种同工酶。结果表明:LDH同工酶有5条酶带;MDH同工酶有5条酶带;Est同工酶有1条酶带。     

多重PCR检测3种鸡球虫方法的建立

根据GenBank中发表的巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫TS-1序列,设计了3对引物,建立了这3种球虫的单一PCR和多重PCR检测方法,并分别对单一PCR和多重PCR方法的特异性和敏感性进行了研究,对巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的混合卵囊进行了初步应用.结果显示:单一PCR和多重PCR均能扩增出巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫特异性条带,其大小分别为151 bp、463 bp、303 bp,其最小检测浓度为0.5ng,对水牛梭形肉孢子虫、有毒艾美耳球虫、猪源弓形虫汤山株及其田间分离株均不起反应,表明建立的方法具有很强的特异性和较高的敏感性,可望用于巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的诊断和田间种类调查.     

柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其在蛋白定位中的应用

为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得2株能稳定分泌Et LDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和2H4,抗体亚类鉴定均为Ig G1,腹水效价分别为1:8000和1:64 000。Western blot结果显示2F7抗体能识别柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中大小约为35 k Da的天然蛋白。利用该单抗对Et LDH在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的分布进行了定位,结果显示该蛋白主要分布于裂殖子的细胞质,表明成功地制备了Et LDH单克隆抗体,为深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基础。     

不同性别野牛草同工酶酶谱分析

利用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳技术对3种性别野牛草(Buchloe dactyloides)的幼叶和幼穗的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)同工酶酶谱进行分析,以期通过酶谱的差异表达对野牛草进行早期性别鉴定。结果表明:雄株野牛草幼穗的POD和PPO同工酶各有1条特异条带Rf0.12和Rf0.15;雌雄同株的幼穗PPO同工酶酶谱中有1条特异条带Rf0.12;雌株的叶片PPO同工酶酶谱有Rf0.12的特异性条带。通过分析上述3种同工酶的酶谱发现,叶片的POD和PPO同工酶酶谱可以用来对野牛草进行早期性别鉴定。     

利用单孢子囊接种技术建立鸡柔嫩艾美耳球虫克隆

利用显微操作从柔嫩艾美耳球虫长春株、河北株、山东株(由单卵囊接种建立)挑选出单孢子囊接种于雏鸡,接种成功率为17.8%。传代后提取DNA,用7条随机引物PCR扩增,鉴别RAPD图谱及特异条带,结果获得柔嫩艾美耳球虫长春株2个克隆、河北株2个克隆、山东株1个克隆。     

鸡艾美耳球虫18SrDNA序列与系统进化分析

为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。     

鸡艾美耳球虫哈尔滨株的分离与鉴定

为研究鸡艾美耳球虫哈尔滨株单一虫种的生物学特性,本研究利用单卵囊分离技术分离了6种鸡艾美耳球虫哈尔滨株,用分离的单卵囊接种雏鸡,同时应用PCR方法对收集的单卵囊分离株进行球虫种类鉴定并进行同源性和系统进化分析.结果显示,分离得到的6株鸡艾美耳球虫分别为柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫,PCR结果表明单卵囊分离株确为该6种纯株.本研究表明毛细吸管单卵囊分离法简便易行,使接种难度降低,提高了接种成功率,为球虫的分子生物学研究奠定了基础.     

四种鸡艾美耳球虫实验室保存株的PCR鉴定

以4种鸡球虫实验室保存株(毒害、巨型、柔嫩、堆型艾美耳球虫)的基因组DNA为模板,分别用针对4种球虫的ITS-1序列设计的种特异性引物进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察特异性条带。结果显示,只有在模板和扩增引物为同一种球虫时,方能扩增出特异性条带。表明本实验室保存的4种鸡球虫均为纯种株,建立的PCR检测方法可以用于鸡球虫纯种的鉴定。     

秦皇岛株鸡柔嫩艾美耳球虫耐药谱变迁分析

试验选用14日龄健康雏鸡154只,随机分为5个感染药物组、1个阳性组和1个阴性组,每组22只。采用POAA、RLS、ROP和ACI综合评定QHD-08株柔嫩艾美耳球虫的耐药谱。结果显示,QHD-08株柔嫩艾美耳球虫对尼卡巴嗪呈现中度耐药,对克球粉、氨丙啉、马杜霉素和瑞冠球均呈现完全耐药;在2004-2008年期间,QHD株柔嫩艾美耳球虫对氨丙啉的耐药变迁结果为无耐药性→轻度耐药→完全耐药;对尼卡巴嗪的耐药性由2006年轻度耐药转变为2008年中度耐药,而克球粉、马杜霉素、氨丙啉和瑞冠球等4种抗球虫药的耐药性均从2006年的轻度(或中度)耐药转变为2008年的完全耐药。结果表明,QHD株柔嫩艾美耳球虫对常用抗球虫药物的耐药谱宽,且耐药率呈逐年递增的趋势。     

蛋鹌鹑组织中乳酸脱氢酶同工酶的研究初探

本文采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法比较分析了24羽蛋鹌鹑的血液以及心、肝、肺、肾、胸肌等组织中乳酸脱氢酶(LDH)同工酶酶谱的分布特征。电泳分离的结果表明：肾组织中乳酸脱氢酶(LDH)有3条酶带，分别为LDH1、LDH2、LDH3，其中LDH3最宽，着色最明显；心、肝、肺和血液四种组织中乳酸脱氢酶(LDH)有两条酶带，分别为LDH1和LDH2，其中LDH2最宽，着色最明显；肌肉组织中只含1条酶带。