猪伪狂犬病病毒北京株的分离鉴定

从北京某猪场疑似猪伪狂犬病发病死亡仔猪脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种ST细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据GenBank公布的PRV的gD基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病病毒基因序列。以上结果证实该病毒为猪伪狂犬病病毒,依据分离地点命名为猪伪狂犬病病毒北京株。     

一株猪细小病毒7群的鉴定和分离

猪细小病毒7群(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是2016年首次从美国猪群发现和鉴定的新的猪细小病毒。为弄清我国猪群中是否存在PPV-7,本文用PPV-7特异性的实时荧光定量PCR和常规PCR方法对采集的10份猪流产胎儿和10份保育仔猪病料分别进行检测,结果发现其中1份保育仔猪样品的常规PCR和实时荧光定量PCR检测结果均为阳性,常规PCR扩增出的246 bp特异性条带测序和分子遗传演化时发现,该序列与PPV-7参考毒株KU5637332和KY996757的同源性分别为99.6%和98.0%,表明该样品中含有PPV-7,进一步用PK-15细胞分离病毒,连续传代5次后PK-15细胞都没有出现典型的细胞病变,但其上清液用实时荧光定量PCR方法都可以检测到该病毒。本研究结果证实我国猪群中存在PPV-7的感染,且检测到的PPV-7毒株能在PK15细胞中增殖。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株的分离与鉴定

从河南省某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该病毒能在 Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变 (CPE),在 Vero、PK-15细胞上不出现CPE.该病毒能被猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清特异性地中和,用 PCR反应能扩增出 720 bp的特异性片段.分离病毒回归 30日龄仔猪可出现高热和呼吸道症状.初步鉴定该分离株为猪繁殖与呼吸综合征病毒.     

上海地区犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析

为了解上海地区犬细小病毒流行毒株的情况,本研究使用病毒分离和PCR技术对上海某犬养殖场采集内脏样品进行了形态学、分子病毒学等鉴定.结果显示,病毒能在MDCK细胞上生长,并产生细胞变圆、破碎、脱落等细胞病变;能凝集猪红细胞.用犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)特异性引物对病毒进行PCR扩增,能够扩增出CPV特异性片段,经序列测定分析与GenBank FJ432316相近.本研究对了解和掌握犬细小病毒流行病学及其变异趋势具有重要的作用.     

一株犬细小病毒云南毒株生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒云南地方毒株的生物学特性,本试验将疑似病犬粪便经处理后接种于F81细胞,逐日观察病毒致细胞病变效应(CPE),对能引起细胞出现CPE的培养物进行病毒粒子电镜观察和分子生物学检测;在此基础上,完成分离病毒的部分生物学特性分析。结果表明,分离物在F81细胞盲传3代后开始出现拉网,脱落,崩解和破碎等CPE现象;电镜下可见病毒粒子呈圆形或六边形,无囊膜,直径约为20 nm;PCR检测出现目的条带,序列分析结果显示该毒株序列和犬细小病毒参考毒株核酸同源性为98.8%~99.7%。该毒株在生物学特性上除具有一般犬细小病毒相关特性外,还表现出异步接毒可致F81细胞出现明显CPE及能凝集食蟹猴红细胞的特性。基于VP2基因序列分析显示分离株基因型为新CPV-2a型,部分有生物学意义位点发生突变,亲缘关系与国内参考毒株关系较远,而与韩国参考毒株亲缘关系较近。提示,本试验成功分离获得一株犬细小病毒云南地方流行毒株,命名为YNX20090901株。     

一株猪细小病毒的分离与鉴定

取疑似猪细小病毒(PPV)流产胎儿组织病料,处理后接种PK-15传代细胞,2~4 d后出现了明显的细胞病变;荧光抗体试验结果显示,PPV呈现阳性;以猪细小病毒VP2基因的1对特异性引物,从PPV疫苗、流产胎儿病料及感染细胞培养物中PCR扩增出158 bp的DNA条带;扩增产物经EcoRⅠ酶切分析,得到了预期的条带(123 bp和35 bp),从而证实PCR方法的特异性;敏感性试验结果显示,PCR的最小检出量为300 pg。研究结果表明,2006年9月发生在贵州省某种猪场的疫情确由猪细小病毒感染所致。     

BHV-1在牛胚气管细胞中的增殖规律研究

为研究牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)在牛胚气管细胞(EBTr)中的生长特性和增殖规律,参考文献设计合成特异性引物和探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法,检测BHV-1感染EBTr细胞6、12、24、48、72、96、120、144h后病毒的增殖规律,并观察对应时间点的细胞病变(CPE)。结果显示,用100TCID_(50)的BHV-1感染EBTr细胞,48h后开始出现细胞病变,72h细胞病变明显,120h细胞大部分变圆,开始脱落,144h细胞大面积脱落、崩解。实时荧光定量PCR检测结果表明,BHV-1感染EBTr在6h~24h内,病毒缓慢增殖,48h~96h,病毒增殖速度加快,拷贝数呈对数增长,120h~144h,BHV-1的含量仍然呈现升高的趋势,但增长速度变慢。结果证明,BHV-1能够在EBTr中产生CPE,而且CPE程度与病毒DNA增殖规律一致,该结果可以为深入研究BHV-1对EBTr细胞的致病机理提供基础资料。     

猪德尔塔病毒H223株的分离鉴定和持续传代及N基因遗传进化分析

从江西某猪场疑似病毒性腹泻的发病猪采集部分小肠内容物样品,应用RT-PCR检测,在排除猪传染性胃肠炎病毒(PEDV)和猪流行性腹泻病毒(TGEV)感染后,检测结果为猪德尔塔病毒(丁型冠状病毒,PDCoV)阳性,将处理后的肠道组织研磨液在ST细胞上进行连续盲传,传至第9代观察到细胞病变(CPE),且普通PCR检测为阳性,目前已连续传代至65代。针对PDCoV编码的N基因设计一对特异性引物,成功克隆了该病毒的N段基因,序列长度为1 248 bp。使用DNA Star和MEGA 7软件对扩增该片段的测序结果进行遗传进化分析,序列同源性分析确证该毒株属于PDCoV,命名为H223。     

靶向O型口蹄疫病毒shRNA转基因猪体细胞抗病毒活性研究

为研究靶向O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因shRNA转基因猪体细胞的抗病毒活性,本实验在成功培育转基因克隆猪的基础上,通过分离与培养转基因猪体细胞,对其shRNA进行PCR和Southern blot检测,并将FMDV感染体细胞中,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析转基因猪体细胞抗FMDV活性。结果表明,转基因猪体细胞基因组DNA中携带有靶向FMDV VP1基因的shRNA基因片段。与非转基因猪体细胞相比,接种FMDV转基因猪体细胞其出现CPE的时间延迟,细胞内病毒含量显著降低,细胞感染病毒36 h时,对细胞中FMDV VP1基因抑制效率为53.6%。表明该靶向FMDV shRNA转基因克隆猪体细胞在体外具有良好的抗病毒活性。本研究为进一步在体内评价转基因动物的抗病毒活性奠定了基础。     

猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原捕捉ELISA方法的建立

为制备猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体(McAb),建立检测猪细小病毒的抗原捕捉ELISA方法 (AC-ELISA),本研究以原核表达的重组VP2蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了2株能稳定分泌抗猪细小病毒VP2蛋白的McAb,命名为3C4、5F8。以多克隆抗体作为捕获抗体、单克隆抗体5F8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测猪细小病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法与日本乙脑病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为93.6%、90.9%、94.4%。本研究建立的猪细小病毒AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于猪细小病毒感染的早期诊断。     

Reproductive failure in wild boars associated to porcine parvovirus infection and in vivo and in vitro characterization of the causal isolate

Investigations were made to identify the causal agent of an acute outbreak of abortions in a domesticated herd of wild boar. Only porcine parvovirus (PPV) was isolated from samples of organs from the still-born sucklings and mummified aborted fetuses. The isolated virus hemagglutinated erythrocytes of guinea pig, murine, rat, and chicken. Identity of the virus, designated the BQ strain, was confirmed by the production of a specific cytopathic effect on susceptible cells and by the results from ELISA, PCR, immunofluorescence assay, and electron microscopy. PPV BQ strain was adapted to growth in a swine testicular cell line. When inoculated into healthy sows, PPV BQ caused the same reproductive disorder observed in the affected herd.     

Mapping of porcine parvovirus DNA and development of a diagnostic DNA probe

Dimeric and monomeric replicative forms of DNA of porcine parvovirus (PPV) strain NADL-2 were isolated and examined by restriction enzyme analysis and reciprocal Southern blot hybridization during development of a DNA probe for PPV. Genomic single stranded PPV DNA was 5.0 kb long, and results substantiated the rolling-hairpin model of parvovirus DNA replication with the primer sequence located in the 3' terminal hairpin loop. An additional finding was the generation of a 4.7 kb species of viral DNA which was considered to be a 0.3 kb deletion variant of genomic PPV DNA. A 3.0 kb DNA fragment obtained by Pst I/Hind III digestion of monomer replicative form DNA was cloned into a plasmid vector, pUC 19. The cloned fragment, recovered from transformed Escherichia coli strain TB1 and labelled with [32P] dCTP, was evaluated by dot hybridization as a probe for PPV in infected cell cultures. The probe was specific for PPV infected cells, and was 100 times more sensitive than the standard hemagglutination test.     

猪细小病毒在兔体内的垂直传播

以猪细小病毒（ＰＰＶ）细胞复壮毒接种于妊娠后１１～１３ｄ的初妊母兔,接毒的初妊母兔均于妊娠后３０～３２ｄ分娩。分娩后立即扑杀接毒母兔及其死产仔兔、对照母兔及其仔兔,分别无菌采集其肝脏和肾脏,按常规方法处理后以银加强胶体金技术进行检测,结果试验兔样本均为阳性,而对照兔样本均为阴性,这表明ＰＰＶ也可在兔体内垂直传播,并引起繁殖障碍。初妊母兔可替代妊娠母猪作为ＰＰＶ人工感染试验的动物模型。     

猪细小病毒2型、3型、6型多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立同时快速检测猪细小病毒2型(PPV2)、猪细小病毒3型(PPV3)、猪细小病毒6型(PPV6)的方法,本研究根据PPV2、PPV3、PPV6各自的NS基因序列设计3对特异性引物,建立了一种能同时检测上述病原的多重PCR方法。结果显示,建立的多重PCR方法对PPV2、PPV3、PPV6的基因组DNA均能有效扩增,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的核酸均无特异性扩增,特异性较强;对PPV2、PPV3、PPV6的重组质粒最低检测限分别为4.32×10^3拷贝/μL、9.62×10^3拷贝/μL、4.25×10^3拷贝/μL,与其他研究者已建立的单一PCR检测结果一致,敏感性较高。利用本研究建立的多重PCR方法对25份可疑临床样品检测,同时利用文献报道的单一PCR方法检测,二者结果一致。本研究建立的多重PCR方法为检测PPV,及该病的流行病学调查提供了技术支持。     

散养户猪群细小病毒感染的血清学调查

为了解大理地区猪细小病毒(PPV)感染的情况,从大理地区58个散养户采集了243份猪血清,采用间接ELISA方法对血清样本进行细小病毒抗体检测。结果显示,243份猪血清中抗PPV抗体阳性率为85.60%,表明大理地区散养户猪群细小病毒病已经普遍流行,结果值得关注。     

猪细小病毒4型Taq Man荧光定量PCR方法的建立与应用

根据GenBank中发表的猪细小病毒4型(PPV4)全基因组序列,针对其结构蛋白VP2基因的保守序列,设计合成特异性引物及TaqMan探针,以VP2克隆质粒为标准品,通过对探针浓度、引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度以及退火温度进行调整,建立了PPV4的TaqMan荧光定量PCR.反应条件优化后,该方法在6.73×10...     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。     

猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

根据猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的基因序列,分别选取各自的保守区段设计引物,通过反应条件的优化,建立了检测PPV、PRV和PCV-2的多重PCR方法.用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行检测,从对临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果看...     

猪细小病毒BQ-C毒株VP2基因的鉴定及表达

本研究从临床发病猪采集病料,以PK15传代细胞进行病毒分离,通过PCR、血液凝集试验(HA)和电镜鉴定为1株猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),命名为BQ-C。对分离的毒株进行测序,结果显示该毒株与GenBank登录的PPV BQ株同源性为100%。为获得该毒株结构蛋白VP2基因的表达产物,将VP2基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+),得到表达重组质粒。经双酶切和测序鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE结果表明,获得的重组蛋白分子质量约为71.5 ku,与预期大小相符。Western blotting结果显示获得的重组蛋白能与PPV阳性血清特异性结合,表明重组蛋白具有良好的反应原性。结果表明,本研究成功分离了1株PPV BQ-C株,且表达的VP2重组蛋白可用于PPV血清学诊断和疫苗的研发。     

猪细小病毒和猪源脑心肌炎病毒的二重PCR检测方法的建立

试验旨在建立能同时检测猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和猪源脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中PPV VP2基因和EMCV 3D基因序列,利用Premier 5.0软件设计出PPV和EMCV的特异性引物。通过优化反应条件,建立了能同时特异性检测PPV和EMCV的二重PCR方法,PPV和EMCV的敏感性检测极限分别达7.62和1.22×10^-1 pg/μL。通过对临床36份样品的检测结果表明,该二重PCR检测方法敏感、特异,适合于临床检测应用。