枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用

参照Gen Bank中登录的枯草芽孢杆菌16S r RNA基因,设计1对引物,扩增片段大小为460 bp的基因片段,该方法对枯草芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,对枯草芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立枯草芽孢杆菌PCR检测方法,且该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点。     

细胞和病毒活疫苗中支原体污染的PCR检测方法建立与应用

[目的]在生物学研究及生物制品生产中易发生支原体污染,针对我国当前支原体检验方法在时效性和敏感性上的不足,建立一种简便快速、特异敏感的支原体检验PCR方法.[方法]从SILVA数据库下载包含全部细菌、古菌和真菌的核糖体rRNA小亚基(16S/18S,SSU)参考序列的库文件SILVA_123-SSURef,从中提取全部...     

气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCA T)和嗜水气单胞菌(Aeromonash ydrophila)的16S rRNA基因的保守区设计2对特异性引物.通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aer...     

抗幽门螺杆菌UreB蛋白免疫乳的制备

诱导UreB蛋白克隆菌株表达UreB蛋白,并制备成亚单位疫苗,免疫正常泌乳奶牛,测定乳清中特异性抗体效价以及牛乳常规成分、血清常规成分等健康指标.结果表明:UreB蛋白表达浓度为0.39 mg/mL;乳清特异性抗体IgG和IgM效价显著高于对照组(P＜0.05),IgA效价有所上升,但未达到显著水平(P＞0.05);奶...     

副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用

[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。     

牛源环孢子虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

 【目的】 建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列，设计1对保守引物和1对特异性引物，建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件，进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段，与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应；最低能检测到2.85×10-2 fg的阳性参照DNA；对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性，有较好的临床应用价值。     

温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立及其应用

为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法,根据温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(GenBank登录号为AY946266),设计1对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列的特异性片段,检测温氏附红细胞体最低DNA量为0.178 fg。利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率分别为10.3%、5.3%、45.8%,说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏省和黑龙江省均存在,流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广。     

用于PCR扩增的细菌DNA提取方法比较

以14个属的革兰阴性菌和阳性菌为研究对象,采用16S rRNA基因PCR扩增对4种细菌DNA提取法进行了比较.结果表明,对细菌DNA的提取效果排序,依次为冻融法、煮沸法、碱解法、ROSE法.冻融法效果最好,具有成本低、省时省力、无污染等优点,但仍存在少数革兰阳性菌DNA提取失败的现象.因此,在菌株较多的情况下可先采用冻融法提取细菌DNA,对少数提取失败的菌株,弃冻融法得到的上清液,再以SDS法、CTAB法或DNA试剂盒的提取进行补充.采用该操作流程既能节省成本和时间,又减少了提取过程中有机废弃物的产生.     

猪磷酸二酯酶7A mRNA荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为研究磷酸二酯酶(PDE)7A基因在猪体内的分布,本试验通过构建含有目的基因片段标准质粒的方法,成功建立荧光定量PCR检测PDE7A基因的标准曲线,可检测到最低1×102copies/μL的初始模板量,重复试验变异系数为2.22%～3.71%,具有较高的灵敏度和可重复性。用该方法检测到PDE7AmRNA在试验用小型猪的心肌中表达量最高(比率为4.54×10-2),骨骼肌次之(1.44×10-2),其他内脏器官较少。     

鸡毒霉形体感染的PCR检测方法的建立及应用

用多聚酶链反应检测了鸡毒霉形体种内菌株的特异性ＤＮＡ片段,并用该法对人工感染鸡及野外野群进行了ＭＧ感染的分子流行病学调查。结果表明,通过基因扩增及电泳,仅ＭＧ出现特生扩增条带,最低能检出１８ｐｇＭＧＤＮＡ,说明该方法具有很高的特异性和敏感性。人工感染６０只鸡,３ｄ后即可用ＰＣＲ查出ＭＧ阳性,６ｄ后１００％为阳性,对照鸡全部为阴性。与分离培养的结果完全一致。ＰＣＲ对野外鸡群的ＭＧ检出率为１０．５－３     

牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法的建立

【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。     

检测牛感染犬新孢子虫的TaqMan-MGB Real-time PCR方法的建立

为建立牛感染犬新孢子虫的Real-time PCR检测方法,根据犬新孢子虫Nc2基因保守序列设计特异性检测引物和TaqMan-MGB探针,建立新孢子虫病TaqMan-MGB Real-time PCR检测方法。PCR扩增产物约为150bp,与预期片段大小相符;Real-time PCR扩增表明,Ct值与梯度稀释的阳性质粒模板呈良好的线性关系;当检测牛源性弓形虫、牛环形泰勒和牛巴贝斯等虫种阳性DNA时均为阴性;经3D数字PCR判定,Real-time PCR方法的最低有效检测量为6.41拷贝/μL,灵敏性是常规PCR的1 000倍;重复性试验的组内平均变异系数为1.108%,组间为2.732%;本方法与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499-2013)的检测符合率为100%(46/46)。该Real-time PCR方法可用于早期诊断和日常监测家畜感染犬新孢子虫。     

罗氏沼虾诺达病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测MrNV的灵敏度大约为RT-PCR的103倍,最低可检测到2.612×10-2 fg MrNV RNA。应用套式RT-PCR和一步法RT-PCR同时对108份来自广西各地的罗氏沼虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有9份检出MrNV,而一步法RT-PCR仅有3份检出MrNV。由此可见,建立的套式RT-PCR检测方法具有极高的特异性和敏感性,能提高MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断,为WTD的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供可靠的技术手段。研究亮点:根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,优化建立了检测MrNV的套式RT-PCR方法。该方法具有极高的特异性和敏感性,最低可检测到2.612×10-2fg MrNV RNA,能提高临床样品MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断。     

基于PLO基因的山羊化脓隐秘杆菌PCR检测方法的建立与应用

为建立特异的化脓隐秘杆菌PCR检测方法,基于化脓隐秘杆菌PLO基因设计4对引物,对12种细菌进行常规PCR扩增,以评价方法的特异性,并运用建立的PCR方法检测临床样本。结果显示只有使用F1/R1引物对的PCR方法能鉴别化脓隐秘杆菌,并能用于临床样本检测。     

舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

马巴贝斯虫PCR检测方法的建立及应用

根据已发表的马巴贝斯虫18S rRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出一条约936 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆于pGEM-Teasy载体,经PCR鉴定后进行序列测定.结果表明,所克隆的目的基因与GenBank中发表的序列同源性达到98.4%.并利用特异性引物初步建立了马巴贝斯虫病PCR检测技术.     

茄科雷尔氏菌IMSA-LAMP检测方法的建立

【目的】桑树青枯病是由茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的一种危害严重的细菌性病害，建立一种快速、灵敏的茄科雷尔氏菌检测方法，对桑树青枯病的有效控制有重要意义。【方法】本研究以茄科雷尔氏菌果胶裂解酶基因（Pectate lyase gene）为靶标，基于等温多自配引发扩增技术（Isothermal multiple self-matching-initiated amplification,IMSA）的引物设计原理，结合环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）的反应体系，建立一种快速有效检测茄科雷尔氏菌的IMSA-LAMP法，并对该方法的最佳反应参数进行了筛选。【结果】基于果胶裂解酶基因建立的IMSA-LAMP检测方法在64.5℃条件下，45 min内可完成对阳性样品的特异检测，对茄科雷尔氏菌的模板DNA检测灵敏度达200 fg/μL （对应菌为1×10²CFU/mL）；对生产上收集的疑似桑树青枯病病样的检出率为87.5%。【结论】IMSA-LAMP检测方法具有良好的实用...     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。     

淀粉诱导奶牛乳脂下降后奶牛瘤胃细菌菌群变化

旨在阐释奶牛日粮添加淀粉对奶牛乳脂及瘤胃细菌菌群变化的影响。选取4头体况相近、健康的泌乳期中国荷斯坦奶牛,试验开始前以基础日粮饲喂并作为对照,饲喂7 d;试验期每头奶牛日粮中添加1.5 kg·d^-1玉米淀粉,饲喂15 d。结果表明,日粮中添加淀粉后,牛奶乳脂率极显著降低(P<0.01)。瘤胃细菌研究表明,在门水平上共检测到28个菌门,玉米淀粉导致瘤胃芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、软壁菌门(Tenericutes)丰度极显著降低(P<0.01),装甲菌门(Armatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)丰度显著降低(P<0.05),厚壁菌门(Firmicutes)丰度显著增加(P<0.05)。在属水平上共检测到383个菌属,其中90个菌属发生显著变化。玉米淀粉导致醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、小球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、毛螺旋菌属-1(Lachnoclostridium-1)、瘤胃球菌属-1(Ruminococcus-1)、普雷沃氏菌属-7(Prevotella-7)等丰度极显著增加(P<0.01),厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、肠球菌属(Enterococcus)、栖水菌属(Enhydrobacter)等丰度极显著降低(P<0.01)。本试验结果表明,奶牛日粮中添加一定量的玉米淀粉对瘤胃细菌多样性和种类分布均匀度均无显著影响,但其促进了大部分产酸菌群的增殖。