抗克百威单克隆抗体的研制

用与牛血清蛋白(BSA)交联的克百威人工抗原(BFNB-BSA)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,得到1株能稳定分泌克百威抗体的单克隆细胞株(1E8)。鉴定结果表明,1E8的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链。制备单克隆抗体腹水,腹水的间接ELISA(酶联免疫吸附分析)效价在1×10-6以上。直接ELISA线性回归方程为y=15.70lg(x)-5.879 5,r2=0.990 4,抑制中浓度IC50=35.1μg.L-1,最低检测限IC20=5.2μg.L-1。该单克隆抗体与克百威特异性结合反应的50%抑制质量浓度为35.1μg.L-1。除丁硫克百威以外与其他克百威结构类似物无交叉反应。     

新城疫病毒单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的新城疫病毒ND35免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合.经筛选,获得5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株.特异性试验表明,7G5单克隆抗体仅与ND35病毒株反应,而不与禽流感病毒AIV(H5亚型)、产蛋下降综合症病毒(EDS-76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、马立克氏病毒(MDV)、禽肺病毒(APV)反应.通过Western-blot对7G5单克隆抗体进行鉴定,发现其在相对分子质量47 500～62 0130之间出现条带,表明其与NDV抗原有特异性结合.这5株单克隆抗体属于IgGl、IgG2b亚类,κ轻链.     

恩诺沙星单克隆抗体的制备及鉴定

 碳二亚胺法合成了2种恩诺沙星(enrofloxacin,ENFX)人工抗原ENFX-BSA和ENFX-OVA,用紫外扫描和分析载体蛋白的氨基酸组成等方法对人工抗原进行鉴定,ENFX与BSA的结合比约为48∶1。用ENFX-BSA免疫BALB/C小鼠,采用显微克隆技术最终筛选出2株特异性分泌细胞2C5和5D5并获取腹水,纯化后腹水效价分别为1∶3200和1∶6400。2C5和5D5均属IgG2a型抗体。单抗5D5间接竞争ELISA(Ci-ELISA)的工作浓度为1∶1000,ENFX的抑制曲线在0.13～10     

三聚氰胺单克隆抗体制备与鉴定

[目的]制备抗三聚氰胺单克隆抗体,并对其效价、敏感性与特异性进行测定。[方法]通过三聚氰胺人工抗原MEL-BSA免疫BALB/c小鼠以及细胞融合等方法,获得分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并利用小鼠体内腹水诱生法制备抗三聚氰胺单克隆抗体;采用间接竞争ELISA法鉴定单克隆抗体的效价、敏感性与特异性。[结果]经小鼠免疫、细胞融合与亚克隆后获得了2株分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1B12和2H9;间接ELISA检测结果显示,杂交瘤细胞1B12和2H9腹水型单抗的效价分别为1∶25 600与1∶12 800,IC50分别为8.0 ng/ml与8.3 ng/ml,且该2种单抗只与三聚氰胺有反应,与三聚氰胺类似物无交叉反应。[结论]该研究获得了高效价、高灵敏度的三聚氰胺特异性单克隆抗体,为后续研究提供了良好基础。     

克百威人工抗原的合成与鉴定

以2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃酚为反应原料,在通光条件下合成了2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯.然后,以其作为反应原料与氨基已酸或氨基丁酸反应,在不同条件下合成了具有羧基的两种活性半抗原6-[[(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基] 氨基]已酸(BFNH)和4-[[(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基] 氨基]丁酸(BFNB).半抗原和牛血清蛋白(BSA)经碳二亚胺法偶联得到了其免疫原,BFNH-BSA和BFNB-BSA的结合比分别为10∶1和13∶1,同时利用混合酸酐法和卵清蛋白经偶联得到包被抗原,BFNH-OVA和BFNB-OVA的结合比分别为4∶1和3∶1.     

绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

为制备绵羊早孕因子(EPF)单克隆抗体,以纯化的EPF重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选单克隆抗体细胞株,将筛选的细胞株注入小鼠腹腔得到腹水型抗体,用G-sepharose柱亲合层析法对小鼠腹水型抗体进行纯化,应用SDS-PAGE和Western blot分析抗体纯化后的纯度及特异性。结果显示,细胞融合后得到了1株抗绵羊EPF单克隆抗体的细胞株B4D5,纯化后的腹水型单克隆抗体纯度较高,具有较强的特异性,应用单克隆抗体检测绵羊妊娠准确率为81.3%。表明,制备的绵羊早孕因子单克隆抗体为特异性抗绵羊EPF抗体。     

抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定

[目的]制备特异性抗沙丁胺醇单克隆抗体,为其免疫学检测方法的建立奠定基础。[方法]用SAL-BSA抗原免疫BALB/c小鼠;使用细胞融合技术建立抗SAL的单克隆抗体（SAL mAb）杂交瘤细胞株;体内诱生腹水法制备SAL mAb,并鉴定其免疫学特性。[结果]筛选出2D9和1C4两株杂交瘤细胞,其细胞培养上清效价达1∶104,腹水效价达1∶106;免疫球蛋白亚型鉴定为IgG1;抗体对SAL的半数抑制浓度（IC50）为1.14 ng/ml;与沙丁胺醇和盐酸克伦特罗的交叉反应率（CR）分别为100.00%和26.09%,与其他化合物无交叉反应。[结论]获得了高效价、敏感且异性的抗SAL抗体,为沙丁胺醇残留的免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

抗雌二醇单克隆抗体的制备与鉴定

活化雌二醇(E2)C3处的酚-OH,与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备得E2的完全抗原,利用完全抗原免疫动物,采用单克隆抗体技术,经过细胞融合、克隆筛选、扩大培养、动物体内诱生腹水等过程,最后获得了E2的单克隆抗体,对纯化的单克隆抗体的性质鉴定,结果显示:其抗体效价为1:106,抗体属于IgG2a型;分子量为179000Da;E2单克隆抗体的亲和常数K2.9108L/mol。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定

用纯化的犬瘟热病毒免疫Balb/C小鼠,采用问接ELJSA方法筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株,挑选阳性孔进行亚克隆,用Vero细胞交叉反应试验及间接免疫荧光试验检测单抗的特异性.结果获得6株能稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体细胞株,分别命名为AD7、AE2、CE3、EH5、GG6和GF1.交叉反应试验及间接免疫荧光染色检测表明,6株单抗的特异性良好;经过体外连续传代及反复冻存、复苏,杂交瘤细胞均能稳定分泌特异性单抗.培养上清液及小鼠腹水ELISA效价分别为26～211和104～107.相加试验表明:单抗AE2、CE3、GG6和GF1具有共同的表位,而单抗AD7和EH5识别的位点与其他4株不同.     

Production and Identification of High Affinity Monoclonal Antibodies Against Pesticide Carbofuran

To produce high-affinity monoclonal antibodies against pesticide carbofuran, and the develop immunochemical assays for people＇s health and environmental protection, the hapten 4-[[（2,3-dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyloxy） carbonyl]- amino]-butanoic acid （BFNB） of carbofuran was synthesized and Balb/c mice were immunized by the hapten-carrier （BFNB-bovine serum albumin, BFNB-BSA） conjugates. The splenocytes of immunized mice were fused with Sp2/0 cells and the cultural supernatants of hybridoma cells were screened by the indirect enzyme-linked immunoabsorbent assay （ELISA）, based on BFNB-ovoalbumin conjugates （BFNB-OVA）. Purified monoclonal antibody （McAb） was obtained from fluids of ascites, deposited by octanoic acid and ammonium sulfate. The affinity and the specificity of McAb were characterized by ELISA or indirect competitive ELISA. A hybridoma cell line （5D3） secreting anti-carbofuran McAb had been established. The titer of culture medium and ascites was up to 1：2.048 × 10^3 and 1：1.024 × 10^6, respectively, and the subtype of the McAb was IgG1. The affinity constant of the McAb was about 2.54 × 10×9 L mol^-1, with an IC50 value of 1.18 ng mL^-1 and a detection limit of 0.01 ng mL^-1. Cross-reactivity studies showed that the McAb was quiet specific for carbofuran, as among the four analogous compounds, they were all hardly recognized （4.59 × 10^-4% for 2,3-dihydro-2,2- dimethyl-7-benzofuranol and less than 3.0 × 10^4% for others）. The prepared McAb had a very high affinity and specificity, and it could be used to develop ELISA for rapid determination of carbofuran.     

Studies on Preparation and Characteristics of Monoclonal Antibodies Against Enrofloxacin and Cross-Reactivity of Related Fluoroquinolones

An ester activation method was employed to couple enrofloxacin(ENFX) to the carrier proteins BSA and OVA. The conjugates ENFX-BSA and ENFX-OVA were identified with an UV spectrophotometer and amino acid automation analysis instrument, and resulted in conjugates with 48 ENFX molecules per carrier molecule(BSA). Splenocytes from mice immunized with ENFX-BSA were fused with SP2/0 myeloma cells and hybridomas secreting antibodies against enrofloxacin were selected and cloned. Two stable monoclonal antibodies, 2C5, 5D5 of the subclass IgG2a, were isolated. Using antibody 5D5, an indirect competitive inhibition enzyme-linked immunosorbent assay (Ci-ELISA) was developed for the quantitative detection of enrofloxacin and its metabolites. The IC50 of the standard curve was 21.67 ng mL-1 and the limit of detection for enrofloxacin was 0.13 ng mL-1. This method was sensitive and had a linear range from 0.13 to 10 000 ngmL-1 (r=-0.9782). Monoclonal antibody 5D5 exhibited high relative affinity to enrofloxacin, and the cross-reactivities with ciprofloxacin,marbofloxacin, sarafloxacin and danorfloxacin were 110.8, 27.40, 71.05 and 37.41%,respectively. Three non-fluoroquinolones of cefadroxil, chloramphenicol, sulfadimethoxine were tested and there was no cross-reaction between them.     

分泌抗苹果茎沟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

 用苹果茎沟病毒（ASGV）免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（Sp2/0-Ag14）融合，经3次克隆化培养和ELISA筛选，建立了7株分泌抗ASGV的单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株。上述细胞株的腹水McAb滴度在1:256000 ～ 1:4096000之间，而且均不与另一种常见的潜隐病毒苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）起交叉反应。腹水McAb经纯化和辣根过氧化物酶（HRP）标记后，用间接ELISA方法检测感染ASGV的昆诺藜汁液，具有特异性强、灵敏度高等特点。     

抗猪IgG单克隆抗体的研制

采用饱和硫酸铵盐析、离子交换柱层析技术从猪血清中提纯IgG.经SDS-PAGE电泳鉴定,纯化的IgG达到电泳纯.以此纯化的IgG,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,融合率为90.3%.建立间接ELISA,用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体.初检阳性率为13.9%.经2次亚克隆反复筛选获得了2株能稳定分泌抗猪IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6B4、4B8.ELISA证实所获得的单抗是特异性针对IgG,6B4、4B8经反复冻存,复苏及多次传代,仍能分泌高效价抗体,分泌抗体均属IgG1、κ型.本研究所获得的单克隆抗体将对检测猪抗体水平及IgG提纯发挥重要作用.     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为获得猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白单克隆抗体,将516 bp的ORF2基因片段克隆入pET-28a(+),转化入大肠杆菌,在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,叠加ELISA方法检测两株单克隆抗体识别的抗原表位关系。SDS-PAGE和Western blot结果表明重组蛋白ORF2得到高效表达;筛选获得两株稳定分泌抗ORF2单克隆抗体的杂交瘤细胞系3H3和3F2,其分泌的单体均为IgG1亚型;且均具有较高的特异性和敏感性;叠加ELISA显示,两株单克隆抗体识别不同的抗原表位。本研究制备的单抗有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速准确诊断方法的建立提供了平台。     

三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

[目的]探讨系统地检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的方法。[方法]通过三甲氧苄氨嘧啶与马来酸酐反应,得到三甲氧苄氨嘧啶半抗原,再通过免疫动物得到抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体,并将其应用于能够检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的ELISA试剂盒。[结果]试验表明,该试剂盒对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34μg/kg,IC50(50%抑制浓度)为4.8μg/L,回收率为60.5%~79.7%,试剂盒的标准曲线范围为0~80μg/L,批内、批间的相对标准偏差均小于10%,三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%,4℃下能够保存12个月,稳定性较好。[结论]研究可为监管三甲氧苄氨嘧啶的滥用提供参考。     

磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)单克隆抗体的制备及初步鉴定

用磺胺间二甲氧嘧啶人工免疫原(BSA-SDM)免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术筛选抗磺胺间二甲氧嘧啶单克隆抗体(SDMmAb)杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SDMmAb,并鉴定其免疫学特性;鉴定结果表明,筛选出3株杂交瘤细胞,单克隆抗体的蛋白亚型为IgG1;分子量为178.1KDa,染色体数目为76～87条。与其他7种磺胺药(SD、SMM、SMZ、SQ、ST、PST、SMT、SPD)有很高的交叉反应性,可用于推广磺胺类药物多残留快速检测试剂盒的研制应用。     

霍山石斛多糖单克隆抗体的制备及多糖组织分布研究

[目的]探讨霍山石斛多糖口腔注射后多糖在小鼠体内的分布状况。[方法]以霍山石斛原球茎中提取的一种多糖与牛血清白蛋白偶联后作为抗原,免疫小鼠获得单克隆抗体,以获得的单克隆抗体为一级抗体对小鼠进行免疫组织化学试验。[结果]证实了CDAP活化法可有效偶联多糖与蛋白质,且以制备的偶联物能引起小鼠免疫反应从而制备出所需的单克隆抗体,利用获得的活性较高、特异性较好的单克隆抗体得到多糖在小鼠组织的分布图。[结论]该方法可为霍山石斛多糖进入机体后分布情况提供科学依据。