棉花内生蜡状芽孢杆菌YUPP-10对棉花黄萎病的防治作用及机制

【目的】棉花黄萎病(Verticillium wilt)是世界性难以防治的病害,筛选有效的生防微生物资源成为解决棉花黄萎病的重要途径之一,本研究旨在分离一株高效拮抗细菌,并明确其防治机理,为生物防治棉花黄萎病提供技术支持。【方法】用葡甘聚糖作为碳源筛选一株能够降解β-1,4糖苷键的棉花内生细菌YUPP-10,通过平板对峙培养、平板对扣培养和悬滴法等测定YUPP-10对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)菌丝生长和孢子萌发的抑制效果;用YUPP-10无菌滤液培养大丽轮枝菌微菌核,检测其对微菌核萌发的影响;利用基质接种法进行盆栽试验探究其对棉花黄萎病的防治效果;通过胚根、叶片接种病原菌,木质化和活性氧爆发研究YUPP-10诱导抗病能力;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测防御相关基因的表达。【结果】成功获取一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)YUPP-10,其整体代谢产物在7 d时对大丽轮枝菌的抑菌带宽为0.73 cm,挥发性代谢产物在10 d时对大丽轮枝菌菌落的抑制率为77.03%;YUPP-10无菌培养液对大丽轮枝菌孢子和菌核萌发的抑制率分别为17.22%—71.25%和10.69%—26.62%,且抑制率与无菌滤液的浓度呈正相关。在用YUPP-10玉米蛭石培养物拌土处理的盆栽试验中,其对棉花黄萎病的最高防效达到80.60%。诱导抗性试验发现YUPP-10诱导了胚根和叶片抗大丽轮枝菌的侵染,诱导了细胞木质化和活性氧的爆发。qRT-PCR检测结果显示YUPP-10成功激活了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、几丁质酶(CHI)和病程相关基因(PR10)的表达,对大丽轮枝菌在棉花体内的扩散和生长起到了抑制作用。【结论】YUPP-10通过直接抑制病原菌的生长,同时诱导植物防御反应来抵抗病原菌的侵染和扩展,其具有良好的应用前景。     

不同寄主来源轮枝孢菌的交互致病性

为了明确不同寄主来源的轮枝孢菌是否存在交互致病性,对来源于向日葵、棉花、茄子、生菜和马铃薯5种不同寄主植物上的10株轮枝孢菌的生物学特性,如菌落形态、生长速度、生理小种、交配型和致病力分化进行研究,并利用大丽轮枝孢菌不同生理小种和交配型的特异引物对供试大丽轮枝孢菌菌株进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测。结果表明,不同寄主来源的轮枝孢菌在菌落形态和生长速度上存在显著差异。PCR检测结果表明:除了来自生菜的大丽轮枝孢菌Ls16-1为1号生理小种外,其余8株不同寄主来源的大丽轮枝孢菌均为2号生理小种;所有供试大丽轮枝孢菌菌株的交配型均为MAT1-2-1型。此外,采用纸钵撕底蘸根法将不同寄主来源的轮枝孢菌分别接种向日葵、棉花、茄子和马铃薯。结果显示,不同寄主来源的菌株对上述不同寄主均表现出不同程度的致病力,但都对自身分离寄主的致病性表现最强。综上表明,不同寄主来源的轮枝孢菌对不同寄主存在交互致病性,但均对其分离寄主的致病性表现最强。     

pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响

微菌核是棉花黄萎病原大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)在土壤中的主要存活形式及该病的侵染源,研究土壤pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响对明确黄萎病发生具有重要意义。采用菌丝生长速率法研究培养基pH及盐分质量浓度与种类对病原菌生长及微菌核形成的影响。供试大丽轮枝菌菌丝生长最适pH为7.0,偏酸或偏碱会抑制菌丝生长,但培养基偏碱可显著促进微菌核形成。当pH为8.0时,大丽轮枝菌菌丝生长受抑制较小,同时微菌核区面积较pH为7.0时增加22.6%。盐分质量浓度影响大丽轮枝菌菌丝生长及微菌核形成。随培养基NaCl质量浓度增加,供试大丽轮枝菌生长受到抑制,菌落面积和菌丝面积均逐渐减小,但微菌核形成量却显著增加;当NaCl质量浓度为10g·L~(-1)时,微菌核区面积较无NaCl时增加40.7%。盐分种类影响供试大丽轮枝菌生长。随盐分质量浓度增加,氯化物(NaCl和KCl)和硫酸盐(Na_2SO_4和MgSO_4)均可促进大丽轮枝菌微菌核形成,而CaCl_2则显著促进菌丝生长,并在质量浓度大于7g·L~(-1)时抑制微菌核形成。在培养环境偏碱性或氯化物和硫酸盐含盐量较高时,均可促进棉花黄萎病原大丽轮枝菌微菌核形成量增加。     

分离自棉花的轮枝菌“种”的鉴定

【目的】已知引起植物萎蔫病的轮枝菌有5个“种”,本研究旨在澄清在中国引起棉花黄萎病的轮枝菌的“种”类。【方法】从中国12个省84个县分离获得310个轮枝菌菌株,采用生物学性状观察和分子鉴定相结合的方法,对其进行“种”的鉴定。【结果】298株均产生黑色微菌核和轮枝状分生孢子梗,为典型的大丽轮枝菌,另有12个菌株培养性状较为特殊（不产生微菌核,出现黑色菌丝或厚壁孢子）,经温度敏感试验、PCR特异扩增及ITS序列进一步鉴定,2株被确定为变黑轮枝菌,其它10株被确定为大丽轮枝菌,没有出现黑白轮枝菌。【结论】在中国三大棉区,棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的。但在长江流域和黄河流域棉区均分离到1株变黑轮枝菌,其在棉花黄萎病发生过程中的作用及其与大丽轮枝菌的互作还有待进一步研究。     

新疆绿豆黄萎病病原菌鉴定

[目的]自2013年以来,在石河子大学农学院试验站和142团良种连田间的绿豆上,常出现一种叶片褪绿,变黄,萎蔫,后期枯死的病害,剖秆检查其维管束变成褐色,查明其病原种类并鉴定.[方法]采用常规组织分离法对病组织进行分离、纯化获得单孢纯培养菌株,通过常规纸钵撕底沾根法接种明确分离菌株的致病性,用形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定.[结果]经常规形态学鉴定,该菌的菌落形态、分生孢子梗和分生孢子的形态都与报道的大丽轮枝菌一致,经分子生物学鉴定,该菌的同源性与中国棉花黄萎病菌Verticilliu mdahliae(登录号EU835817.1)序列同源性最高,达99.58;.故将其鉴定为pdahliae.[结论]在石河子地区绿豆上所发生的叶片褪绿,变黄,萎蔫,维管束变色,后期枯死的病害是由大丽轮枝菌所引起的绿豆黄萎病.黄萎病是一种典型的土传病害,在黄萎病重病田轮作倒茬时不要种植绿豆,以免引起毁灭性的损失.     

5种植物提取物及残体对棉花黄萎病菌的抑制作用

【目的】研究5种植物提取物和残体对大丽轮枝菌的抑制作用,为利用生物熏蒸技术防治棉花黄萎病提供依据。【方法】以棉花黄萎病主要致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)XJ2008菌株为试材,测定韭菜、葱、薄荷、藿香和薰衣草5种植物的甲醇、水提取物,对大丽轮枝菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,并将植物残体以质量分数2%添加到600g基质与田园土的混合样中混匀后,测定植物残体对大丽轮枝菌微菌核萌发的影响。【结果】5种植物提取物均对大丽轮枝菌的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用,随着植物提取物质量浓度的增加,抑制作用增强,甲醇提取物的抑菌作用略强于水提取物;韭菜提取物的抑制作用最强,藿香次之。植物残体对大丽轮枝菌微菌核的萌发有明显抑制作用,其中藿香残体的抑制作用最强,薄荷、韭菜次之,薰衣草最弱。【结论】韭菜、藿香对大丽轮枝菌的抑制作用十分明显,有作为生物熏蒸材料的潜力和应用前景。     

北京地区黄栌黄萎病病原菌的研究

从北京地区黄栌黄萎病病组织及病土壤中分离到轮枝菌属中的2个单孢菌系.经黄栌幼苗的回接证明,2个菌系致病力很强,分别为95％和77.5％.2个菌系都能形成大量的微菌核;分生孢子梗基部的细胞无色透明;在梅干培养基上形成特征性的黑色颗粒状菌落;在30℃温度下均能生长.鉴定黄栌黄萎病病原菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb).2个单孢菌系在致病力、形态结构、菌落形态以及生长温度等方面存在差异.另外,笔者对V.dahliae Kleb.2个单孢菌系的生物学特性进行了测定.     

棉花黄萎病内生拮抗细菌的分离及LC-04菌株的鉴定

从棉花根、茎、叶部组织中分离到19株对棉花黄萎病菌大丽轮枝菌有枯抗作用的细菌,其中抑菌圈直径大于20mm的菌株1株.直径10～20mm之间的菌株5株,直径小于10mm的菌株13株.分离自棉花叶部组织的LC-04菌株对大丽轮枝菌V-190菌株生长的抑制作用最强.通过时LC-04菌株菌体形态、菌落特征的观察和一系列生理生化试验分析,该菌株鉴定为类芽孢杆菌属细菌.     

吉林省大丽轮枝菌培养性状与遗传特性及致病性分析

茄子黄萎病发生在门茄坐果后,是危害茄子生产的重要病害.茄子黄萎病由大丽轮枝菌引起,为深入研究吉林省大丽轮枝菌的群体遗传变异,对分离自吉林省的36株大丽轮枝菌进行培养性状观察、遗传特性分析和致病性鉴定.大丽轮枝菌菌株在PDA培养基上培养14 d后形成菌核型、中间型2种菌落形态,其中83.3％的为菌核型,16.7％为中间型,未分离得到菌丝型菌株.利用PCR技术检测大丽轮枝菌的Ave1无毒基因、致病类型、交配型.结果表明,36株大丽轮枝菌均不含Ave1无毒基因,致病类型均为非落叶型,交配型均为MAT1-2.选取6株大丽轮枝菌进行致病性鉴定,结果表明,6株大丽轮枝菌均可不同程度引起茄子黄萎病,其中2号大丽轮枝菌菌株致病力最强,4号菌株致病力最弱.研究结果可为茄子抗黄萎病育种和针对性制定茄子黄萎病防控方法提供技术支持.     

石河子地区秋葵黄萎病病原菌的鉴定

对出现维管束变色、植株矮化且叶片变黄的秋葵植株茎秆应用组织分离法进行分离、纯化,获得单孢菌株。用孢子悬浮液接种水培秋葵幼苗进行致病性测定,并通过形态学观察及分子生物学对病原菌进行鉴定。结果表明,供试秋葵菌株的菌落特征,分生孢子、分生孢子梗和微菌核形态均与大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)一致;经分子生物学鉴定,供试菌株的ITS-ACT基因序列与大丽轮枝菌(V.dahliae,登录号:HQ206859和HQ206856,HQ206975和HQ206966)相似性达99.5%以上。因此,将引起石河子地区秋葵黄萎病的病原菌鉴定为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),且非落叶型和落叶型菌系均能侵染秋葵。     

新型选择性培养基检测土壤棉花黄萎病菌效果初报

介绍了一种用于检测土壤棉花黄萎病菌的选择性培养基。该培养基成份为:鲜棉叶100g,蔗糖5g,琼脂17~20g,40%PCNB0.3g,氯霉素、链霉素和青霉素各0.05g,水1000ml,pH6.4~7.0。该培养基与其它常见分离培养基相比,成份简单、操作简便,检测率显著,抑菌效果好,病菌在其上生长快、菌落典型,是一种较为理想的选择性分离培养基。     

A Novel Method Isolated Microorganisms in Soil Granule

A novel method isolated microorganisms in soil granule was built. The key steps included： repeated elutriation of soil by sterilized water, inoculation on the plates with the elutriated sediments, incu...     

Physiological mechanisms involved in resistance to cotton verticillium wilt induced by AM fungi

It was proved that arbuscular mycorrhizal (AM) fungi played an important role in increasing plant resistance to soilborne pathogens, especially when plants were pre-inoculated with AM fungi. Mechanisms involved in this phenomenon are not yet well understood. On the basis of the former experiment results in our lab, effects of AM fungi on cotton Verticillium wilt and the mechanisms of increasing disease resisitance by the tested fungi were studied in pot culture under greenhouse conditions. …     

棉花大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)血清学检测--抗原处理的比较

分别以棉花黄萎病菌V20的菌丝研磨物、菌丝蛋白、超氧化物歧化酶酶带Ⅰ、超氧化物歧化酶酶带Ⅱ为抗原免疫家兔,制备了抗血清As1、As2、As3、As4。琼脂双扩散法(ADD)和间接ELISA方法测定其特异性,发现这4种抗血清既可与同种的抗原发生阳性反应,也可与不同种的抗原发生交叉反应。用异种抗原黑白轮枝菌和尖孢镰刀菌吸附这4种抗血清,排除其非特异性成分后,抗血清专化性明显提高,消除了交叉反应。特异性测定表明:经吸附后的4种抗血清可以准确地将大丽轮枝菌鉴定到种的水平,但仍不能区分其生理型和致病类型。另外,当分别使用菌丝研磨物或菌丝蛋白为特异性测定抗原时,ADD检测的结果虽然一致,但前者阳性反应沉淀线粗糙,轮廓不清晰,后者的沉淀线较细,且清晰、明显。因此适宜选择菌丝蛋白为抗原进行抗血清的特异性测定试验。     

新疆紫草毛状根提取物的抑菌活性研究

为了研究新疆紫草毛状根的抑菌活性与新疆紫草根的抑菌活性是否相似,以甜瓜叶斑病、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌5种菌为供试菌,采用滤纸片法和菌丝生长速率法,对新疆紫草毛状根紫草素粗提物及多糖进行抑菌活性研究。结果表明:乙醇提取物对3种细菌均具有抑制作用,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强。丙酮提取物仅对甜瓜叶斑病菌有抑制作用,其抑制作用较乙醇提取物高26.5%。乙酸乙酯和石油醚提取物对3种细菌均无抑制作用;4种溶剂提取物对2种真菌均有抑制作用,且对棉花黄萎病菌的抑制率均高于枯萎病菌;乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、丙酮提取物对甜瓜叶斑病菌的MIC均为0.1 mg/mL,乙醇提取物对大肠杆菌的MIC为6.25 mg/mL;毛状根多糖对2种真菌均具有抑制作用,且对棉花黄萎病的抑制作用较棉花枯萎病高26.14%,而对3种细菌均无抑制作用。     

土样风干等处理对直接检测土壤黄萎菌的影响

对影响检测土壤黄萎菌几个主要因素的研究表明,延长培养时间能显增加土壤黄萎菌检测效果,当培养３周和４周时,黄萎菌检出率分别为８７％和９６％。黄萎菌检测量随每皿培养其中接种量的增加而增加,并非按比例增加,有达到最高极限值的趋势,数学模型Ｙ＝ｂ（１－ｒ＾２）可以通过接种量ｘ,计算出培养４周后土壤黄萎菌菌落检测数ｙ。土样无论在分析前风干,还是风干后贮存１个月,对土壤黄萎菌检测效果都有显的影响。     

蛋白激酶A催化亚基VdPKAC1对菌丝型大丽轮枝菌V07DF2培养性状及致病力的调控

【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料（2B5、C5和HH2）进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体（2B5、C5和HH2）与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。     

Gliocladium virens(GVP)的半选择性培养基

本文分别测定了没食子酸和16种抑制物质在马铃薯琼脂上对Gliocladium virens(GVP)菌落生长的影响,设计出以没食子酸,PCNB、虎红、马铃薯汁以及常用抗菌素组合的半选择性培养基 GSM1和GSM2。通过与与其他几种用于分离土壤真菌的培养基作稀释平板分离,比较了对 GVP 的选择性。发现 GSM 对土壤中 Gliocladium virens 在平板上的回收率,相对菌落数以及菌落形态等方面较好,可以应用于 Gliocladium 的分离和计数。     

新疆主要棉区棉花黄萎病菌致病力分化及其遗传多样性分析

测定了源于新疆棉区的22个棉花黄萎病菌单孢菌株和3个落叶型棉黄萎病菌菌株T9、VD8和V151对4个棉花品种上的致病力.采用随机引物聚合酶链反应(RAPD)技术分析了这些菌株的遗传多样性.结果表明:供试的25个棉花黄萎病菌之间的致病力存在显著差异(P<0.05).在各棉花品种上,22个新疆菌株中都有与T9、VD8或V151的致病力差异不显著的菌株,说明新疆存在较强致病力的棉花黄萎病菌菌系.RAPD分析表明,供试的8个随机引物中6个可以从25个菌株的基因组DNA中稳定地扩增出多态性DNA片段.对扩增片段统计结果表明,供试菌株间遗传相似系数变化幅度为0.57～1.00.聚类分析表明,在阈值0.625处可将25个菌株分为4个RAPD群(命名为RG1、RG2、RG3和RG4),RG1包括2个菌株,即B、BL-19菌株; RG2 包括5个菌株,即BL-17、BL-13、N-5、H、N-16;RG3为最大一个亚群,包括T9、SL等16个菌株;RG4包括2个菌株,即VD8和V151.综合分析表明新疆棉花黄萎病菌的致病力强弱和菌株的采集地等遗传背景存在一定的差异,这可能与各主产棉区的频繁引种有着直接的联系.     

大丽轮枝菌分泌蛋白提取方法比较

【目的】采用超滤法（UF）、三氯乙酸沉淀法（TCA）、离子交换富集法（IEX）分别从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）高致病性菌株VdG1培养上清液中提取分泌蛋白,对提取样品进行质谱鉴定。寻找适合大丽轮枝菌分泌蛋白的提取方法,为大丽轮枝菌分泌蛋白组深入研究奠定基础。挖掘大丽轮枝菌分泌蛋白中潜在的致病相关蛋白,为其深入功能验证及致病机理研究提供平台。【方法】3种方法提取大丽轮枝菌VdG1分泌蛋白,shot-gun方法进行质谱鉴定。利用生物信息学软件WoLFPSORT、SignalP、TMHMM、PHOBIUS对其中经典分泌蛋白进行预测。通过CAZy和PHI数据库进行经典分泌蛋白中碳水化合物水解酶（CAZy）和病原菌寄主互作因子（PHI）注释,BLASTp软件进行RxLx、LysM、Cys Pattern等模体蛋白比对分析。提取的蛋白样品接种感病棉种（军棉1号）进行样品生物学活性及致病性检测。【结果】TCA法、IEX法和UF法制备大丽轮枝菌分泌蛋白,其提取效率分别为1.18、0.96和0.56 mg?L-1。SDS-PAGE电泳检测显示UF法提取的蛋白样品条带少而模糊。而TCA法和IEX法提取的蛋白样品条带较多,样品的纯度也较高;经生物信息学软件预测分析,提取的蛋白样品中含有经典分泌蛋白分别为124、112和75个;质谱鉴定的分泌蛋白中含有潜在致病因子分别为98、85和57个;另外,IEX法制备大丽轮枝菌分泌蛋白效果较好,具有小分子偏好性,且能够保持样品的生物学活性,该蛋白样品接种棉花叶片能够引起萎蔫、坏死的症状。【结论】3种方法提取大丽轮枝菌分泌蛋白,UF法提取效率最低,纯度最差,蛋白数量最少,蛋白样品中含有潜在的毒素蛋白数量也最少,而且对于大体积处理相当耗时。TCA法和IEX法都适合大丽轮枝菌分泌蛋白的制备,但是TCA法制备过程中不能保持样品的生物学活性,后续适合于2-D电泳检测等试验。IEX法首次应用于病原菌分泌蛋白的制备,操作简单、方便,全部过程均由仪器系统完成。制备的大丽轮枝菌分泌蛋白具有生物学活性,能够引起棉花叶片的萎蔫、坏死病症。另外,数据库及软件比对分析发现大丽轮枝菌分泌蛋白组中含有CAZy酶类61个、PHI相关蛋白38个、RxLx模体蛋白13个、LysM模体蛋白1个、Cys Pattern的模体蛋白15个、VdNEP蛋白家族2个。该结果将为致病相关蛋白的筛选和深入功能验证提供重要依据。