单克隆抗体诊断家蚕浓核病

<正> 养蚕中流行的家蚕浓核病,是造成蚕茧歉收的原因之一。本病是由家蚕浓核病病毒(BmDNV)感染蚕体后引起发病的,这种病毒是一种没有包涵体的昆虫病毒,与过去报导的传染性软化病病毒(IFV)不同,浓核病病毒为直径21nm的球状粒子,病毒核酸为单链DNA,侵入家蚕中肠,在园筒细胞核内形成病毒粒子,而传染性软化病病毒为单链RNA,直径约27nm的球状粒子,侵染家蚕中肠杯状细胞,在细胞质内形成病毒粒子。     

家蚕品种7532和大造在高温冲击下中肠抗氧化酶活性的变化

为了探讨家蚕抗高温冲击的生理机制,比较了高温(36℃)冲击对家蚕二化性品种7532和大造5龄幼虫死亡率和中肠抗氧化酶活性的影响。自5龄24h起,供试家蚕品种大造经高温冲击24h以后,幼虫的累计死亡率就显著升高;而7532经高温冲击48h以后,幼虫的累计死亡率才显著升高。高温冲击48～72h,7532的5龄幼虫中肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性较高,且随高温冲击时间延长显著增加,而大造5龄幼虫中肠组织中SOD的活性较低,且高温冲击时间延长后的变化不显著;7532的5龄幼虫中肠组织中的过氧化氢酶(CAT)活性在高温冲击48h后显著升高,而大造5龄幼虫中肠组织中的CAT活性在高温冲击24h后显著下降,直到72h后才显著升高,并且7532中肠组织中的CAT活性显著高于在大造中肠组织中的活性;2个品种5龄幼虫中肠组织中的谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性分别在高温冲击24h和48h时达到峰值,在高温冲击48～72h期间,7532中肠组织中的GST活性显著高于大造中肠组织中的活性。上述结果提示,家蚕品种7532抗高温冲击能力较家蚕品种大造强,与其中肠组织中的抗氧化酶活性升高有关。     

家蚕氨肽酶N家族基因在5龄幼虫中肠组织的表达分析

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一种偏好水解蛋白质或寡肽N端中性氨基酸的酶,在鳞翅目昆虫中主要分布于中肠上皮细胞的刷状缘囊膜上,是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体(Cry)毒素的重要受体蛋白。为了研究家蚕APN家族基因的表达特征,运用Real-time PCR技术检测分析该家族基因在不同家蚕品种幼虫中肠组织的表达差异以及同一家蚕品种幼虫中肠组织中该家族基因各个成员的表达丰度。在所有供试家蚕品种的幼虫中肠组织均可检测到APN家族基因的表达,但不同化性家蚕品种间APN基因的表达水平存在显著差异(P<0.05),而相同化性品种间的差异较小(P>0.05);在同一家蚕品种幼虫中肠组织中,APN2、APN4、APN5基因的表达量较高,而APN1及APN3基因的表达量较低。研究结果有助于进一步研究家蚕APN家族基因的作用机制,并为家蚕抗Bt品种的选育提供理论依据。     

家蚕近等基因系感染浓核病毒(BmDNV-Z)前后中肠组织蛋白的差异表达分析

家蚕浓核病毒(BmDNV)是危害家蚕的主要病毒之一。为鉴定与家蚕抗病毒相关的蛋白质,以对BmDNV完全不感染的家蚕品种兰10(L10)为供体亲本,将其抗性基因导入家蚕敏感品种菁松(JS)中,构建抗性近等基因系NIL(BC6F2)。对JS及其近等基因系NIL分别用家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)添毒,二者分别表现为高度敏感和完全不感染。对JS和NIL在病毒感染前后中肠组织蛋白双向电泳(2D-PAGE)图谱中的差异蛋白点进行串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,共鉴定了41个差异表达的蛋白点,其中有35个蛋白点可能与病毒的诱导相关,有6个蛋白点可能与家蚕的组成抗性相关。鉴定的差异表达蛋白包括糖酵解酶类、能量代谢酶类、参与基因表达的蛋白质以及参与其它细胞功能的蛋白质等。选取10个差异表达蛋白点进行基因表达定量PCR分析,进一步确证了这些蛋白质在JS及其近等基因系NIL之间以及在病毒诱导前后的差异表达。例如:精氨酸激酶在NIL和JS中均可被诱导表达;V-ATP合成酶及热激蛋白HSP70只在NIL中被特异性诱导表达;烯醇化酶在NIL中的表达水平显著高于JS,且不能被病毒感染所诱导,是一个典型的组成抗性相关蛋白。鉴定出的41个差异表达蛋白点有可能参与了家蚕对BmDNV-Z的抗性。     

家蚕5龄幼虫农药中毒后中肠和丝腺组织中的部分金属元素含量变化

蚕体内的金属元素是细胞和组织生理活动不可或缺的基本成分,维持其平衡对家蚕的正常生长发育非常重要。为了解家蚕农药中毒后体内金属元素含量的变化规律,分别给5龄幼虫添食不同浓度的辛硫磷、溴虫腈药液后,运用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对幼虫中肠、丝腺组织中的金属元素Ni、K、Na、Rb和Fe进行定量分析。用ICP-MS法检测各金属元素含量在一定质量浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数在0.998 0~0.999 9之间。研究结果表明,家蚕5龄幼虫添食辛硫磷和溴虫腈药液后,中肠和丝腺组织中Na、K元素平衡发生变化;由辛硫磷导致的中毒会使幼虫2个组织中的Ni元素含量降低,而溴虫腈中毒会使幼虫2个组织中的Rb元素含量降低。家蚕幼虫中肠和丝腺组织中上述4种金属元素含量的变化,对家蚕农药中毒的生理生化机制研究有重要参考价值。     

家蚕中肠上皮细胞增殖和分化的初步研究

通过分析家蚕自幼虫期到蛹期发育过程中肠上皮细胞的增殖与分化情况,鉴定家蚕中肠干细胞的潜在定位。采用苏木精和伊红(Hematoxylin and Eosin,H&E)染色与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色追踪变态和发育时期家蚕中肠的形态结构及细胞组成变化,结果显示,幼虫经历蜕皮及变态时,中肠形态结构以及中肠上皮细胞组成均发生明显变化:在幼虫每个龄期的盛食期肠壁较薄,眠前期(蜕皮前)明显变厚,至眠期其厚度达到峰值;中肠上皮层存在柱状细胞(CC)、杯状细胞(GC)和再生细胞(RC)3种细胞,3种类型细胞随龄期逐渐增多,其中各龄期柱状细胞持续增多,至眠期达到峰值,靠近基底膜的小细胞在眠前期增多。利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)和磷酸化组蛋白(Phospho-histone H3,PHH3)免疫荧光染色检测到中肠上皮细胞,尤其是中肠上皮层靠近基底膜处的小细胞在幼虫各龄眠前期的增殖率最高。同时通过BrdU滞留标记实验在中肠上皮层靠近基底膜处发现了BrdU滞留阳性信号。研究结果发现家蚕幼虫蜕皮时中肠上皮层靠近基底膜处的小细胞发生快速增殖,推测这些小细胞中存在着潜在的家蚕中肠干细胞。     

家蚕浓核病毒中国(镇江)株基因组的克隆及重组质粒转染家蚕对浓核病毒的拯救

家蚕浓核病毒中国(镇江)株(BombyxmoriDensovirus Zhenjiang Strain,BmDNV-ZJ)包含VD1和VD2共2种基因组DNA。以BmDNV-ZJ感染家蚕中肠总DNA为模板,采用PCR方法扩增得到2种DNA,并将其克隆到质粒pGEM-T构建了重组质粒pGEM-VD1和pGEM-VD2。采用DEAE-dextran转染技术,将2种重组质粒分别导入家蚕幼虫体内,能使家蚕幼虫发病,免疫双向扩散和免疫酶组化法检测都能检出阳性反应,但转染pGEM-VD2重组质粒的家蚕幼虫发病率较低。通过重组质粒转染方法,可以使BmDNV-ZJ感受性品种和抵抗性品种都发病,但感受性品种的发病率较高。将重组质粒转染发病蚕的中肠匀浆,取上清液经口接种健康蚕幼虫,也能使其发病。上述结果表明,携带BmDNV-ZJ DNA的重组质粒在家蚕幼虫体内拯救出了感染性的病毒粒子。     

家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1在不同BmNPV抗性水平家蚕品种间的表达差异

家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。     

家蚕蜕皮激素22激酶2(BmEcK2)的序列及基因表达特征分析

前期研究发现在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,Bm CPV)的家蚕幼虫中肠中,有一个下调表达的差异蛋白可能参与了家蚕对Bm CPV感染的抵抗过程。利用Blastp进行同源性比对的结果显示,该蛋白质与尺蠖(Operophtera brumata)的未知蛋白质OBRU01_04785和蜕皮激素22激酶(Ecdysteroid 22-kinase)的序列相似度分别为51%、49%,进一步通过多序列比对和系统进化分析发现该蛋白质与Ecdysteroid 22-kinase蛋白的亲缘关系最近,属于蜕皮激素激酶超家族;该蛋白质与家蚕中已知的蜕皮激素22激酶1(Bm Ec K1)的序列相似度为24.4%,因此将其命名为Bm Ec K2。实时荧光定量PCR检测Bm Ec K2基因m RNA在家蚕5龄幼虫中肠组织中的转录水平最高,其次是马氏管、丝腺和卵巢,而在血淋巴、头部、精巢、脂肪体中几乎检测不到转录;家蚕5龄起蚕感染Bm CPV后24、48、72 h,中肠中Bm Ec K2基因m RNA的转录水平下调,分别是对照组家蚕中肠的0.32、0.45和0.21倍。研究结果初步提示,Bm CPV感染导致家蚕中肠中的Bm Ec K2下调表达,进而可能影响到家蚕体内激素调节水平的变化。     

微量菊酯类农药对家蚕细胞色素P450酶9家族基因转录水平的影响

昆虫细胞色素P450酶广泛分布于各种需氧生物,是一类参与机体代谢解毒或代谢活化作用的超家族酶系。分析家蚕细胞色素P450酶基因表达对微量菊酯类农药的响应,有助于从分子水平阐释家蚕对农药的生理代谢机制,以及探讨细胞色素P450酶活性与家蚕对农药耐受性的关系。以对菊酯类农药耐受性不同的2个家蚕品种为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测分析2个家蚕品种5龄第3天幼虫添食微量(0.02 mg/L)氰戊菊酯后主要解毒组织中肠和脂肪体中3个P450酶9家族基因的转录水平变化及在品种间存在的差异,结果表明:敏感性家蚕品种Lan5的幼虫脂肪体组织中CYP9a19和CYP9a20基因m RNA的转录水平与对照组幼虫相比显著下调,在中肠组织中2个基因的转录水平变化不大,而CYP9a22基因m RNA在中肠和脂肪体中的转录水平均无显著变化;耐受性家蚕品种Mysore的幼虫中肠组织中CYP9a19和CYP9a22基因m RNA的转录水平与对照组幼虫相比均显著上调,CYP9a20基因m RNA在脂肪体组织中的转录水平也显著上调。研究结果提示:细胞色素P450酶9家族基因的转录水平变化,可能与家蚕不同品种对菊酯类农药的耐受性差异有关。     

新烟碱类杀虫剂吡虫啉对家蚕幼虫生长发育及食物利用的影响

吡虫啉(imidacloprid)是新烟碱类杀虫剂,在农林害虫防治中广泛使用。在已明确吡虫啉对家蚕的毒性基础上,采用质量法研究吡虫啉导致的家蚕慢性中毒对幼虫生长发育及食物利用的影响,并采用酶活力测定法分析吡虫啉对5龄幼虫中肠3种消化酶(淀粉酶、蔗糖酶、海藻糖酶)活性的影响。添食高浓度(10~(-1)和10~(-2)mg/L)吡虫啉药液对家蚕3龄和5龄幼虫的生长发育及食物利用有明显抑制作用,幼虫的体质量及其增加量、相对生长率、取食量、相对取食量、食物利用率、食物转化率均显著降低(P≤0.05),而近似消化率显著升高(P≤0.05);添食低浓度(10~(-3)、10~(-4)和10~(-5)mg/L)吡虫啉药液对家蚕3龄和5龄幼虫的生长发育及食物利用则有促进作用,幼虫的取食量、相对取食量、消化量、食物利用率和近似消化率均显著高于对照(P≤0.05),同时体质量及其增加量、相对生长率也升高。添食低浓度吡虫啉药液对5龄幼虫中肠内淀粉酶和海藻糖酶的活性起促进作用;而添食高浓度吡虫啉药液在幼虫5龄1~5 d时对中肠内淀粉酶和海藻糖酶的活性起抑制作用,随着幼虫的生长发育,酶活性逐渐恢复正常并高于对照。吡虫啉对5龄幼虫中肠的蔗糖酶活性具有抑制作用,且添食药液浓度越大,抑制作用越明显,至5龄后期又恢复到正常水平或高于对照。试验结果表明,家蚕添食不同浓度吡虫啉药液后的慢性中毒过程中,蚕体的生长发育、取食行为、对食物的利用和消化吸收等均发生了显著变化。     

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。     

氟中毒对家蚕幼虫中肠组织糖原分解代谢调节的影响

用酶偶合系统测定了氟中毒对家蚕幼虫中肠组织糖原磷酸化酶活性的影响，其结果人氟中毒使中肠糖原磷酸化酶ａ型和ｂ型的活性均明显下降，特别是ｂ型的活性下降幅度较大。由此时以认为，氟中毒抑制了家蚕幼虫中肠组织内糖的分解代谢，使细胞的能量供应减少。     

纳米氧化锌对家蚕的急性毒性测试

纳米材料已广泛地应用于人们的日常消费品中,其生物安全性也随之成为关注的热点。以家蚕5龄幼虫作为实验动物,分别将不同浓度纳米氧化锌水悬浊液由幼虫腹部注射入蚕体,研究其对家蚕的急性毒性。测定纳米氧化锌对家蚕5龄幼虫48 h的致死中量(LD_(50))为737.31μg/头,参照全球化学品统一分类和标签制度(GHS)的分级标准,其毒性等级为3级。观察家蚕3龄幼虫染毒后12 h即出现了抽搐、表皮皱缩、禁食等中毒症状。调查统计染毒后12 h起幼虫的体质量极显著低于对照组。组织病理学观察染毒后48 h幼虫中肠、丝腺、脂肪体、气管等组织的细胞均出现不同程度损伤甚至破裂。其中,中肠上皮细胞受损,围食膜出现大量破损;丝腺细胞空隙基本消失,腺腔内容物极少;脂肪体细胞连接松散;气管管壁细胞基本脱离、消失,螺旋丝发生了融合解聚。试验结果表明,纳米氧化锌可在一定程度上抑制家蚕的生长和消化,并对家蚕的组织细胞产生较明显的不良影响。试验结果可为家蚕作为特殊模式动物研究纳米材料的急性毒性提供试验方法参考。     

家蚕幼虫生长过程中的Logistic曲线

<正> 家蚕幼虫在某一龄期内逐时生长所增加的重量是不相同的,将这逐时测得的体重连成一条曲线时,大致呈“S”形,对于家蚕幼虫的生长曲线,曾有一些学者作过研究,1809年Robertson提出生物的生长可以用单分子反应式来表示,1926年八木首先将该式用于家蚕幼虫的生长,由于Robertson式应用在家蚕幼虫生长上误差较大,1934年大工原孝对该式加以修改,1956年我国学者吴载德抛弃了拘泥于以单分子反应为基础的Robertson式,从家蚕幼虫所形成的“S”形生长曲线的理论上加以研究,创造了新的家蚕生长式。     

谷胱甘肽硫转移酶参与家蚕氟化物耐受性形成的研究

利用对氟化物高度敏感的家蚕品种733新和高度耐受性品种T6构建耐氟近等基因系,对回交15代的近等基因系群体从幼虫2龄眠起开始至4龄第3天连续添食200 mg/kg Na F溶液浸渍的桑叶,调查蚕体重要代谢酶类谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因表达和酶活性的变化。解剖获取4龄3 d幼虫中肠组织进行双向电泳分析的结果显示,近等基因系群体中耐氟个体中肠的GST表达量比敏感个体明显上调。进一步利用实时荧光定量PCR检测GST基因在耐氟个体与敏感个体中肠、血淋巴、脂肪体和马氏管中的相对表达量,并对5龄1~6 d幼虫中肠、血淋巴中的GST酶活力进行测定。结果表明,家蚕对氟化物的抵抗力可能与体内GST酶活力的强弱有关,由于受氟化物刺激的诱导,可能导致GST基因表达水平发生了变化。研究结果为进一步探索家蚕耐氟机制提供了有用信息。     

家蚕幼虫蛋白水解液的研制及其降血糖效果初探

基于进一步开发利用家蚕调节血糖之保健功效的目的,取5龄第3天家蚕幼虫,用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化,超滤后制成家蚕幼虫蛋白水解液。用新方法制备的家蚕幼虫蛋白水解液中氨基酸与其干物质的质量分数为36.64%,对肠α-葡萄糖糖苷酶活力的抑制率为家蚕裂解后未水解产物的94%,而尿酸含量较蚕粉降低了80.5%。用家蚕幼虫蛋白水解液饲喂小鼠,典型Ⅱ型糖尿病动物模型小鼠的空腹血糖浓度和餐后2 h血糖浓度分别降低了16.73%和41.1%,轻度Ⅱ型糖尿病动物模型小鼠和高糖高蛋白高脂肪食物喂养小鼠的血糖浓度(禁食6 h)分别降低了15.5%和10.3%。研究结果表明,家蚕幼虫蛋白水解液不但营养丰富,而且是一种理想的血糖调节剂。     

家蚕浓核病病毒越冬存活力试验初报

家蚕病原体的越冬方式及其存活力是蚕病流行病学研究的一个重要内容。关于家蚕浓核病病毒(BmDNV)的越冬途径,日本学者渡部仁等曾做过研究,认为是通过在以幼虫越冬的桑树害虫桑螟的消化管组织内呈慢性增殖来实现的。我国王裕兴等则认为通过病蚕尸体及蚕室土壤实现病毒的越冬也是可能的。为了解广东家蚕浓核病病毒的越冬存活力规律,为养蚕生产防治浓核病提供依据,作者等于1986年12月至1987年3月和1988年11月至1989年3月进行了两次越冬试验,现将结果报告如下。     

蜕皮激素诱导家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的表达变化

昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是一种核内受体,为蜕皮激素的分子靶标。用0.002 g/L蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫,采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测家蚕蜕皮激素受体基因BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因BmUSP在家蚕幼虫马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化,分析蚕体组织以及BmEcR和BmUSP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。结果表明:家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著,在脂肪体中的转录水平最高,其它组织相对较低;BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著,且在脂肪体中的转录水平最高,马氏管次之,中肠最低。另检测正常情况下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对于其它发育时期较高,且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高水平表达,表明了脂肪体在蜕皮激素代谢过程中的重要性。     

不同饲料育条件下家蚕幼虫中肠细菌的多样性分析

为研究不同饲料饲育对家蚕幼虫中肠细菌多样性的影响,以家蚕品种秋丰×白玉为研究对象,分别以桑叶、NOSAN饲料和自制饲料饲育至5龄盛食期,取家蚕中肠样品进行16S rDNA高通量测序。结果发现,不同饲料育家蚕中肠的细菌菌群存在显著差异,NOSAN饲料育家蚕中肠的菌群丰度较高,而桑叶饲育组与自制饲料饲育组的菌群丰度相当。不同饲料育家蚕中肠菌群的功能基因在代谢途径上存在显著差异,且自制饲料饲育组与桑叶饲育组之间的差异明显大于NOSAN饲料饲育组与桑叶饲育组之间的差异。研究结果为开发优质家蚕人工饲料和探究肠道菌群对寄主的适应机制提供了参考。