检测犬细小病毒和犬瘟热病毒联合PCR/RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立一种能同时检测犬细小病毒(CPV)和犬瘟热病毒(CDV)的快速鉴别PCR方法,试验根据GenBank中登录的CPV NS1基因和CDV F基因序列设计2对特异性引物,通过综合CPV单项PCR方法与CDV单项RT-PCR方法的扩增程序,最后确定出联合PCR/RT-PCR方法的最佳退火温度、延伸时间和循环次数等反应程序,并对扩增产物进行克隆鉴定,同时进行特异性试验、敏感性试验和临床病料的检测。结果表明:建立的联合PCR/RT-PCR方法可以在一个扩增体系内同时检测两种病毒,其最佳联合PCR/RT-PCR扩增退火温度为50.8℃;经特异性分析,联合PCR/RT-PCR方法对犬副流感病毒(CPIV)、狂犬病毒(RV)、犬腺病毒(CAV)的检测为阴性;经敏感性分析,联合PCR/RT-PCR方法在模板浓度稀释到1×10~0 TCID_(50)时仍能见到较清晰的特异性条带;应用联合PCR/RT-PCR方法对延吉市36份犬病料样本进行检测,CPV阳性率为25.00%,CDV阳性率为33.33%,CPV和CDV混合感染阳性率为8.33%。说明试验建立的CPV和CDV联合PCR/RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于犬细小病毒病和犬瘟热病毒病的临床诊断。     

犬腺病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的CAV Hexon基因序列和CPV VP2基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。经过条件优化建立了检测CAV和CPV的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以含有CAV Hexon基因和CPV VP2基因的重组质粒标准品为模板绘制标准曲线,其相关系数(R~2)均大于0.990,CAV和CPV荧光定量PCR均具有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅对CAV-I型、CAV-II型和CPV检测结果为阳性,而对犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒检测结果均为阴性,表明其特异性强。该方法的敏感性检测结果显示其检测下限为10拷贝/μL。重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。利用普通PCR方法与本实验建立的方法分别对感染CAV(10份)和CPV(27份)的犬模拟病料样品进行检测,两种方法对CAV和CPV检测的符合率分别可达100%和96.30%。本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于CAV和CPV的临床检测。     

同时检测犬瘟热病毒和犬细小病毒双重PCR方法的建立

为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。     

CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

犬细小病毒与犬冠状病毒双重PCR检测方法的建立

近年来犬细小病毒病和犬冠状病毒病门诊量升高,2种病毒感染后临床症状相似,且存在混合感染、难以区别。本试验根据GenBank已发表的序列,应用Primer 5.0软件对CPV-2、CCV保守区设计引物,采用不同条件进行PCR反应,验证引物特异性,确定反应条件,建立了检测CPV和CCV的双重PCR检测方法。采用该方法对部分诊所收集的140份CPV和CCV疑似病例的病料进行病原学检测,将双重PCR检测结果与单个PCR检测和胶体金试纸检测结果进行对比。结果表明,该方法敏感性高于胶体金试纸,特异性高,双重PCR检测结果与单个PCR检测结果一致,可用于CPV和CCV的病原检测。     

犬细小病毒套式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速的犬细小病毒(CPV)病原检测方法,本试验根据GenBank上登录的CPV基因序列,在保守的VP2基因内部设计合成内外2对引物,建立了检测CPV的套式PCR方法。该方法对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCoV)、犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)的扩增结果均为阴性;该检测方法最低可以检测出0.1 ng的病毒核酸,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。建立的套式PCR方法具有良好的特异性、敏感性,可以准确快速检测出极低含量的CPV,将为CPV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的检测方法。     

犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV(684 bp)、CPV(213 bp)和CCV(417 bp)的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系只能扩增CDV、CPV、CCV,而不能扩增犬腺病毒Ⅱ型(CAV-Ⅱ)和犬副流感病毒(CPIV);敏感性试验表明,该方法对CDV、CPV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10-2、6.0×10-2和6.7×10-2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。采用建立的三重PCR方法对北京、山东地区收集的临床粪便样品进行检测结果表明,使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%。以上结果表明该方法快速、敏感、特异性强,对上述3种病毒能够进行快速鉴定诊断,为临床诊断提供了快速简便的方法。     

犬细小病毒PCR诊断方法的建立及对大熊猫粪便的检测

根据GenBank中登录的犬细小病毒(CPV) VP2基因序列,设计合成1对特异性引物;以CPV疫苗株为模板,建立了一种快速检测CPV的PCR检测方法,并应用于CPV诊断.结果显示,以此对引物进行PCR扩增能得到与理论设计值大小一致的342 bp的特异性条带,对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)扩增结果均为阴性;最低可检出约1.4 pg的病毒核酸;重复性试验结果表明,其检测重复性好;对45份临床宠物犬病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测拭纸捡测结果进行比较,吻合率为90.0％.将此方法初步应用于大熊猫粪便中细小病毒的检测,结果表明,从熊猫基地采集的52份正常大熊猫粪便样品中有8份为细小病毒阳性,阳性率为15.3％.大熊猫是通过自然感染还是弱毒苗感染细小病毒的机制还不清楚.     

CDV、CPV、CAV-2及CPIV多重PCR的建立及应用

为建立一种快速检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPIV)的多重PCR方法,参照Gen Bank中的相关病毒基因序列,分别设计了4对引物,用于特异性扩增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和CPIV NP基因上的目的片段。通过优化反应条件,建立了同时扩增CDV(410 bp)、CPV(253 bp)、CVA-2(655 bp)和CPIV(868 bp)的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法,对CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV和犬冠状病毒(CCV)的DNA或c DNA模板进行扩增,发现该方法的特异性良好。利用建立的多重PCR方法与单一PCR方法进行敏感性比较,发现两者敏感性相差10倍,证明多重PCR方法敏感性良好。利用该方法对从北京市采集的30份犬病料样品进行检测,发现CDV阳性率为63.33%(19/30)、CPV阳性率为33.33%(10/30)、CAV-2阳性率为6.66%(2/30)、CPIV阳性率为0(0/30)。检测结果证明建立的多重PCR方法可用于临床诊断。     

基于重组酶聚合酶扩增技术的犬细小病毒快速检测方法的建立

为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验结果显示,除CPV (BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性;敏感性试验结果显示,以重组质粒pEASY-CPV-VP2为模板,RPA的检测下限为1×10~1拷贝/μL,其敏感度比普通PCR方法高10倍。利用建立的RPA方法对疑似CPV感染的临床样品的阳性检出率为88%,高于普通PCR的检出率(82%)和胶体金的检出率(76%)。本研究建立的CPV RPA检测方法操作简单,反应灵敏,结果确实可靠,适用于CPV的快速检测。     

犬细小病毒PCR检测方法的建立

犬细小病毒(CPV)于1978年被首次发现,并随后在全世界范围内流行,对养犬业造成严重损失。为了进一步解决CPV在临床上的快速诊断问题,研究者针对犬细小病毒的VP2基因设计特异性引物,希望建立快速简便的检测CPV核酸的PCR方法。     

小熊猫犬细小病毒福州株的分离鉴定

为获得自然感染小熊猫的犬细小病毒(CPV)野毒株,以快速检测试纸确诊的且具有犬细小病毒病临床症状的发病死亡小熊猫肛门棉拭子、口腔棉拭子和抗凝血为病料进行CPV的PCR检测后,将病料预处理并接种于F81细胞盲传至培养细胞出现病变,收集细胞毒并进行PCR鉴定,接种细胞毒给2月龄健康幼犬进行回归试验。结果显示,小熊猫肛门棉拭子、口腔棉拭子和抗凝血的CPV PCR检测均为阳性。病料接种F81细胞盲传第5代时,细胞病变明显,细胞接毒72h后出现拉网、皱缩、崩解、脱落。细胞毒的PCR扩增产物测序结果与已经发表的CPV-js23和2010-BJ-A64毒株相应序列的同源性均为100%。接种细胞毒的幼犬出现了犬细小病毒病特征性症状。结果表明,获得了对小熊猫毒力较强的CPV野毒株。     

犬细小病毒黑龙江流行株的分离鉴定及其VP2基因的遗传进化分析

为了解黑龙江省犬细小病毒(CPV)的流行情况,本研究从黑龙江省哈尔滨市、双城市、鹤岗市和大庆市的宠物医院共收集了 10份经胶体金拭子检测为CPV阳性的犬粪便样品,利用F81细胞进行病毒的分离,并对分离的病毒进行PCR、血凝性试验、病毒分型鉴定和VP2基因的遗传进化分析.结果显示,有8份处理后的病料样品接种猫肾细胞F81...     

3种犬细小病毒感染诊断方法比较

本研究应用犬细小病毒抗原快速检测试剂盒、血凝/血凝抑制试验和PCR方法对120份具有腹泻/呕吐症状的患犬粪便样本进行了犬细小病毒检测。结果显示,3种方法检测阳性份数分别为60,49,68。犬细小病毒抗原快速检测试剂盒与血凝/血凝抑制(HA/HI)试验相比较,敏感性、特异性及总符合率分别为100.0%,84.5%,90.8%;与PCR法相比较,敏感性、特异性及总符合率分别为85.3%,96.2%,90.0%。从试验结果看,HA/HI法具有较高的特异性,但敏感性较低;PCR具有高度敏感性和特异性,但不适合临床推广;细小病毒抗原快速检测试剂盒,在正确操作下结果可靠,是临床诊断犬细小病毒感染的首选方法。     

犬细小病毒2c亚型毒株的分离与鉴定

采集一疑似犬细小病毒(CPV)患犬的粪便,用纳米PCR方法对病料进行CPV检测,并应用猫肾细胞F81进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒在F81细胞中的增殖动态。利用PCR扩增分离病毒的VP2基因,测序结果用DNAMAN软件对获得的VP2基因序列进行拼接,并与NCBI上已经公布的犬细小病毒的全基因组序列以及相关蛋白的核酸序列进行比较,确定其所分离的病毒株型并推导氨基酸序列。结果表明,纳米PCR检测结果为CPV核酸阳性,病料接种到F81细胞培养后出现明显细胞病变(CPE),血清学鉴定为CPV抗原阳性,序列测定分析表明,该毒株VP2基因开放阅读框(ORF)为1755 bp。进化分析显示,该毒株属于CPV-2c型,并命名为CPV-2c-Guangxi23。     

犬细小病毒LAMP检测方法的建立

为提高犬细小病毒(CPV)的检出率,降低检测成本,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种新型敏感、特异、快速、简便、实用的检测CPV的技术。针对CPVVP2基因保守区设计6条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,并检测其敏感性、特异性。所建立的方法最佳反应时间为60min,具有良好的特异性,与同属的其它病毒无交叉反应。该方法对CPV的最低检出量为9.3×10-5ng/μL,其敏感性是PCR的100倍。结果表明,该方法特异性强、敏感性高,并且操作简便、检测成本低,检测时间短,在CPV的综合防治和早期诊断方面具有很高的实用价值。     

犬细小病毒JL-M13株的分离鉴定及全基因组序列分析

将检测为犬细小病毒(CPV)阳性的病料经处理后接种F81细胞盲传3代并获得一株细小病毒,命名为JL-M13。应用重叠PCR技术从JL-M13中扩增出5条核苷酸序列,拼接后进行序列分析。结果表明,所获病毒核酸基因组大小为4 621bp,与其他犬细小病毒的基因相似性为98.2%~99.4%。系统发育树分析表明,JL-M13与CPV-2毒株(EF011664.1)相似率最高,与Type-2型犬细小病毒疫苗株相距较远。     

环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立

旨在建立一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测犬细小病毒感染的新方法。根据Gen-Bank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、敏感性、可视化效果和应用效果进行研究。结果显示,在65℃等温条件下、1h内可完成LAMP扩增过程;病毒的最低检出限量为10-2个TCID50/mL;特异性和可视效果良好;对36份临床标本进行检测,阳性检出率为80.5%(29/36),检出率高于普通PCR 72.2%(26/36)。建立的LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。     

犬细小病毒检测方法研究进展

随着犬细小病毒变异亚型毒株的增多及所呈现的复杂的流行态势,提高犬细小病毒(CPV)检测方法的实用性、敏感性、特异性和简单快捷性迫在眉睫。通过对传统分子生物学和免疫学检测方法的优化改进,相继衍生出了MT-PCR、ii PCR、IC-LAMP、CPV-GIA、PCR-RFLP和RPA等新型方法,明显提高了检测的时效性及便捷性。就衍生出的多种新型检测方法优势特点进行了综述,以期为CPV的临床和实验室快速检测提供参考。     

犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。