猕猴桃EST序列的SSR信息分析

从NCBI公共数据库中最新公布的猕猴桃表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）中随机抽取56,400条序列,应用SSRHunter软件查找微卫星（Microsatellite,SSR）重复序列。研究结果表明,从猕猴桃EST序列中获得了7939条SSR,其中包括二核苷酸重复5131条（64.63%）,三核苷酸重复1237条（15.58%）,四核苷酸重复284条（3.58%）,五核苷酸重复397条（5.00%）, 六核苷酸重复890条（11.21%）。大约每2.48kb 长度的单一基因序列中即存在1个SSR, 即平均7个单一基因中存在1个SSR。二核苷酸重复序列是最丰富的重复单元,其次为三核苷酸重复和六核苷酸重复。在所获得的SSR重复单元中,AG/CT为优势重复,共分布4654条（90.70%）。通过筛查猕猴桃EST序列中的SSR,可为猕猴桃基于EST-SSR的分子生物学研究奠定理论基础。     

花生EST-SSR分子标记的开发

利用NCBI的Genbank数据库中公布的花生53177条EST序列以及本实验室创造的花生栽培品种E12(Arachis hypogaea L.)所构建的Unigene文库中的4 074条EST序列,对这些序列进行前期处理(去除冗余序列,对含有重叠区域的EST序列进行拼接),总共获得非冗余且拼接较长的序列11 260条.通过软件分析发现两个EST库中共包含有1 323个SSR位点,主要是2个和3个核苷酸重复,除此之外也有少量的4核苷酸重复以及复合重复.这些EST-SSR平均长度为18.88 bp,平均每8.5条EST序列就包含有一个SSR位点.其中AG/TC、CTY/GAA重复出现的频率最大,分别占到2个核苷酸重复和3个核苷酸重复的39.3%和22.6%.     

大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)EST-SSR信息分析与引物筛选

为了研究大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV),对大白菜及芸薹属中与抗性有关的EST序列进行了搜索和SSR筛选,并根据SSR两端的序列设计引物,以1对大白菜TuMV抗、感材料的基因组DNA为模板,对上述引物进行了筛选。结果表明,在132条大白菜EST和895条芸薹属抗性EST序列中,共筛选出166个符合条件的SSR(16.2%)。其中包含6种核苷酸重复基元,占主导地位的分别是二核苷酸重复(33.7%)和三核苷酸重复(50.0%),其余重复类型所占比例较小。根据上述SSR两翼的序列,共设计引物196对。引物筛选结果表明,能够进行成功扩增的有156对,占79.6%,其中35对引物在2份材料中具有多态性。因此,利用芸薹属中抗性有关的EST序列设计SSR引物,可用于大白菜TuMV抗性有关基因的标记。     

鹅掌楸EST-SSR引物开发及通用性分析

通过对6520条鹅掌楸EST序列进行检索,在364条ESTs中发现394个SSRs,鹅掌楸EST-SSRs平均密度为每8.5kb含有1个SSR;在检索出的SSRs中,二核苷酸重复单元的SSRs类型最多,占总数的61.9%。利用SSR-ESTs序列共设计176对EST-SSR引物,其中132对在鹅掌楸上有扩增产物,66对扩增出多态,多态性引物占所设计引物的36.9%。这批EST-SSR引物在物种之间具有较高的通用性。研究表明在鹅掌楸中表现多态的66对EST-SSR引物,85%在中国马褂木中有扩增,54%在白玉兰中有扩增。     

NCBI和cDNA文库中栽培花生EST-SSR分子标记的开发及其特点

本研究利用NCBI的GenBank数据库中公布的花生86 132条EST序列以及利用高油酸品种E12所创建的cDNA文库中的12 501条EST序列,对这些序列进行前期处理,总共获得非冗余且拼接较长的singleton 11 260条,contig 9 972条.通过MISA软件分析发现两个EST库中共包含有3 104个SSR位点,占到总共非冗余序列的11.08%.这些SSR位点被分成二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复以及混合核苷酸重复等,其中三核苷酸重复占的比例最多,分别占到NCBI和cDNA文库的43.0%和56.8%,二核苷酸和五核苷酸重复占到所有重复位点的第二位和第三位,六核苷酸重复的比例最少.在所有重复基序中,AG/TC重复的数量最多,分别占到NCBI和cDNA文库的8.65%和13.42%.在三核苷酸重复中,CTT/GAA出现的频率最大,分别占到6.7%和13.42%.所有这些SSR基序的长度在4～51个之间.     

辣椒EST-SSR标记的开发

对4000条辣椒EST序列进行筛选,获得了119条含有SSR的EST,共设计出35对EST—SSR引物,占所有EST序列的0．87％。在所有的SSR—ESTs中,二核苷酸重复含量最高,其次是三核苷酸重复。GA和AGA分别是二,三核苷酸重复中含量最高的重复基元。以不育系（cytoplasmic male sterility,CMS）,保持系基因组DNA为模板,对EST—SSR引物进行筛选,首次获得Pe21、Pe26和Pe27等3对特异引物,并扩增出特异片段分别为CMSPe2160、CMSPe260、CMS Pe27300. EST—SSR标记作为功能基因的一部分,可以直接揭示或反映相关基因功能,特异标记基因的一部分序列,它的应用将对进一步研究辣椒胞质雄性不育分子机理带来一定的促进作用。     

甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛EST资源的SSR信息分析

利用生物信息学方法对NCBI公共数据库的1 458条三浅裂野牵牛ESTs序列进行EST-SSRs信息特征分析。结果显示,剔除低质量的和冗余的序列后,得到总长度为334.368 kb无冗余序列868条。这些无冗余序列中有35个微卫星简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR),分布于35条EST中,出现频率为4.03%,平均分布距离为9.55 kb。在2～6核苷酸的重复类型中,二、三核苷酸SSR之和占总EST-SSR的68.57%,其中三核苷酸SSR占总SSR数量的45.71%。在所有重复单元中,所占比例最高的是AT/AT(14.29%),其次是TCT/AGA为11.43%,TAA/TTA为8.57%列第3位。在所有的SSR中,EST-SSRs重复次数5次的有13个,占全部SSR的37.14%,其次是重复次数为4次和7次,各有5个,占全部SSR的14.29%。结果说明,甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛的EST-SSR出现频率较高、类型丰富、具有一定的研究利用价值。     

西瓜抗枯萎病相关EST-SSR的信息分析

对西瓜枯萎病菌生理小种1诱导的抑制差减杂交cDNA文库测序获得的4000条EST进行分析,经过前处理后拼接得到1487条unigene序列,全长为759 kb.在其中978条unisene序列中共检索出2136个EST-SSR,出现频率为53.4%.EST-SSR的平均分布距离和平均长度分别是1/0.36 kb、19.59 bp.EST-SSRs中的重复单元以二核苷酸和三核苷酸重复为主,二者在总EST-SSRs中的出现频率为98.08%.GA/TC和GAA/TTC是二、三核苷酸中的优势重复类型,分别占二、三核苷酸重复的25.78%和12.97%.西瓜抗枯萎病相关EST资源的SSR信息分析为进一步建立西瓜EST-SSR标记和探索其在西瓜基因组学研究中的应用奠定了基础.     

番薯属甘薯与牵牛EST-SSR标记开发及通用性分析

通过对番薯(Ipomoea)属的12 812条甘薯和28 422条牵牛EST唯一序列进行检索分析,在319条甘薯EST序列中发现了共328个EST-SSRs,平均每20.41 kb出现1个甘薯SSR;在936条牵牛EST序列中发现962个EST-SSRs,平均每17.87 kb出现1个SSR;在检索到的甘薯和牵牛EST-SSRs中,二核苷酸重复类型的SSR最多,分别占各自检索总数的44.51%和40.64%。利用SSR-ESTs分别设计了36对甘薯EST-SSR引物和92对牵牛EST-SSR引物,其中有28对甘薯引物在8个甘薯品种中有扩增产物,13对引物扩增产物具有多态性,多态性引物占所设计甘薯引物的36.1%;42对牵牛EST-SSR引物在甘薯基因组中可以扩增出清晰的条带,其中19对有表现较好的多态性,占设计的牵牛EST-SSR引物的20.7%。结果表明,牵牛EST-SSR标记在甘薯上具有通用性,可用于甘薯基因组多样性分析。     

马铃薯基因组编码区域SSR位点的分布、特征和所编码蛋白功能分析

在不同物种中,微卫星(simple sequence repeats,SSR)序列的数目、类型及其分布情况有很大差异。本研究利用Perl语言开发用于探寻编码区SSR位点的程序,并用SSRHunter软件验证,来分析马铃薯基因组编码区中SSR位点的分布情况。结果显示:在马铃薯的56 218条编码区序列中,检索到2 920条共含有3 512个SSR位点的序列,其中2 519条序列只含有一个SSR位点(占86%);含三核苷酸、六核苷酸重复单元的SSR数目最多,分别为2 358和1 075个,两者占总数的98%,其他类型的重复单元出现次数较少;构成微卫星序列的不同重复单元有603个;六个核苷酸的重复单元重复次数一般最少为三个,三核苷酸GAA重复单元重复次数最高,为193次。在自然选择规律下,编码区中SSR序列长度趋向于密码子的整数倍。运用Pfam数据库对含有SSR的编码序列进行功能分类,其中最多的是RPW8抗性蛋白功能。可利用SSR序列的特异性,筛选马铃薯不同物种的相关编码序列。     

Homologous analysis of SSR-ESTs and transferability of wheat SSR-EST markers across barley, rice and maize

Summary Comparative genetic analysis has shown that different plant species often share orthologous genes for very similar functions, especially for cereal crops. In this study, we focused on analyzing the utility of EST-SSR markers among monocots in silico and by experiment. Based on 423,611 wheat ESTs, 101,299 were found to express commonly in rice, maize and barley ESTs, which accounted for 23.94% of wheat EST data. 1707 SSR-containing ESTs (SSR-ESTs) were mined from the 101,299 homologous ESTs, which accounted for 8.8% of all the 19,434 wheat EST-SSRs. It showed that the number of homologous SSR-ESTs much less than the homologous ESTs among grasses. The number of conserved ESTs and SSR-ESTs were inversely proportional to the evolutionary distance among species. Although these SSR-ESTs were in high similarity, the number of conserved SSRs between wheat and the other three crops decreased with the increased aligning regions, and only 13 types of SSR motifs in 21 ESTs were obtained by aligning sequences over a stretch of more than 40 bp. The variation at a microsatellite came from not only the differences in the numbers of repeat units and its location shift, but also base mutations flanking microsatellite repeats. From the 428 uni-SSR-ESTs universally in the four cereals, 243 primers were designed and tested in two genotypes of each species. 154 (63.4%) primers produced clear amplicons across the four species, which showed a high efficient transferability of wheat EST-SSR markers to the other three cereal crops.     

棉花非冗余性EST-SSR新标记的开发及其评价

利用Clustal X等软件对公共数据库现有的393 753条棉花EST序列分析,得到349 815条非冗余EST序列,借助自主开发的SSRmine软件共发掘SSR位点11 372个,分布于10 507条EST中,EST-SSR的频率是3%,平均相隔21 kb出现一个SSR。在2~6 bp的重复基元中,三核苷酸和六核苷酸分别占34.1%、40.6%,二、三、四、五和六核苷酸基序分别以AG/CT、AAG/CTT、AAAT/ATTT、AAAAG/CTTTT和AAAAAG/CTTTTT的类型最多。利用去冗余的且在亚洲棉、陆地棉、海岛棉中没有被开发过的410条EST序列设计开发了200对非冗余性SSR引物,利用自主开发的SSRD软件通过SSR引物序列下载、预处理、Blastn、提取相似性分值≥81%的引物编号、提取引物冗余对、冗余引物写成一行等6个步骤去除来源于自身部分同源序列以及与CMD释放的不同棉种相似性SSR引物,得到了非相似性引物,定名为CRIXXX (CRI即Cotton Research Institute)。并分别选用棉花12个种的代表性材料对其中100对进行引物功效评价,包括多态信息含量(polymorphism information content, PIC)及引物通用性研究。结果显示,从自主开发的100对SSR引物筛选出56对均能在12份材料间扩增出稳定明显的条带, 其中多态性引物35对,多态率占35%。引物的PIC变幅为0.097~0.888,平均为0.482;1对海岛棉EST-SSR引物在12份材料间的通用性为100%,25对亚洲棉引物通用性为81%,74对陆地棉引物通用性为80.1%。     

小麦背景下冰草6P染色体特异EST标记的开发

小麦-冰草[Agropyron cristatum (L. ) Gaertn.] 6P附加系普冰4844-12具有多粒等可用于小麦改良的优异基因。为高效率检测由小麦-冰草6P附加系衍生的易位系和渐渗系,以普冰4844-12及其亲本普通小麦Fukuhokomugi和冰草Z559 (2n=4x=28, PPPP)为材料,通过对冰草转录组测序获得的EST序列设计的P基因组EST分子标记引物,筛选在普通小麦背景下的6P染色体特异分子标记。结果从1 453对P基因组EST引物中筛选出130对小麦-冰草6P附加系特异标记引物。进而将这些特异标记与NCBI nr蛋白质数据库及小麦EST序列进行了比对,发现4条冰草EST序列的功能注释与抗病、抗逆相关;36条冰草EST与已经定位的小麦EST具有较高的相似性,其中33条(91.67%)位于小麦第6部分同源群染色体。为了进一步验证这些标记的特异性,分别对其中4个具有功能注释的EST标记在中国春等7个普通小麦背景下和随机选择的5个标记在小麦-冰草6P易位系背景下进行了检测,结果证明其确实可用于检测6P染色体。这些冰草6P染色体特异标记的开发为大规模地鉴定小麦-冰草衍生后代中P染色质成分奠定了基础。     

枳壳EST-SSR标记的开发

GenBank上已公布的枳壳EST序列为开发新的SSR标记提供了宝贵的数据资源。本研究利用在线SSR鉴定软件SSRIT分析来自枳壳EST数据库的11029条Unigene序列。分析结果共发现327条EST序列含有348个SSR位点,占总数的2.96%。其中,三核苷酸重复的SSR类型最多,共有161个,占检索总数的46.26%。Primer 3.0设计合成58对EST-SSR引物,其中36对能扩增出产物,6对引物产生多态性分离,分别占所设计引物总数的62.07%和10.34%。本文研究成果为今后枳壳遗传多样性分析、遗传图谱构建及比较基因组等研究方面奠定了基础。     

草棉EST-SSRs的遗传评价

根据GenBank中公布的247条草棉EST序列,搜索SSR并进行引物设计。其中的25条序列含有27个SSR,1~6碱基重复类型都存在,二碱基和三碱基重复的频率较高。为了明确在A、D和AD基因组中的可转移性,依据25条序列共设计25对EST-SSR引物,其中22对引物扩增出清晰可辨的DNA条带,产生92个多态性片段,平均每对引物产生3.64个多态性片段。引物的多态性信息含量(PIC)在0.49~0.91之间,平均为0.81。6对引物在BC₁种间作图群体[(鄂棉22 × Pima3-79) ×鄂棉22]中表现多态性,产生7个多态性位点,其中5个为共显性,2个为显性。除HAU230b标记在BC₁分离群体中不符合孟德尔式分离比例,其余引物表现正常分离。6个位点被整合到陆地棉和海岛棉种间BC₁遗传连锁图谱上的6条染色体：有4个位于A亚基因组的4条染色体上(Chr.6、10、11和12),2个位于D亚基因组的2条染色体(Chr.19和20)。     

小麦抗白粉病SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式

为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制,构建了白粉菌接种初期的抑制性消减杂交cDNA(SSH-cDNA)文库。从中随机挑取140个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列后,得到94条EST,利用NCBI的BLAST在线序列比对工具对GenBank的蛋白质数据库进行同源性比对及功能分类。结果表明,49个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%)。经文库比较,筛选出与病程相关蛋白基因同源的EST(Z25-1)和与谷胱甘肽硫转移酶同源的EST(Z440-1),GenBank登录号为EX567369和EX567360。以其EST序列为依据设计引物,通过RT-PCR分析它们在白粉菌诱导下的表达模式,结果该2基因表达存在明显差异。其中,Z25-1在未接种白粉菌时具有一定的表达量,白粉菌侵染后表达量开始上升,侵染72 h时表达量最高,然后下降;Z440-1在未接种时也具有一定的表达量,但在接种初期表达微弱,甚至不表达,24 h后表达开始上升,到72 h时达最高,然后下降。本研究表明,病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因,且参与白粉病抗病反应,在白粉菌诱导72 h时表达量最高。     

小麦EST-SSR标记的开发和染色体定位及其在追踪黑麦染色体中的应用

根据小麦盐胁迫诱导和茎秆组织相关EST序列开发了81对EST-SSR引物, 其中67、46、18和61对分别在小麦、黑麦、簇毛麦和大麦基因组中稳定扩增, 在不同小麦和大麦品种间具有多态性的引物分别有22和23对。利用小麦缺体-四体系共定位了43对引物的81个位点, 其中A、B和D染色体组上分别有29、30和22个位点, 涉及除4B、3D和6D外的18条染色体。此外30对引物在黑麦基因组中具有特异扩增, 其中8对分别在黑麦1R、4R、5R和R7染色体上具有特异扩增, 7对在多条黑麦染色体具有相同扩增。这些新标记可有效用于小麦及其近缘物种的遗传作图与比较遗传研究。     

基于松树EST序列的马尾松SSR引物开发

本文用生物信息学方法对松树359 521条EST进行处理,得到无冗余EST序列56 776条,其中有2 315个SSR分布于2 057条EST中,出现频率是4.08%,平均距离是22.06 kb.检测到二、三碱基重复SSR总数为1 631个,四碱基至六碱基重复SSR共117个.在所得二碱基以上重复SSR中,多态潜能高的有488个,占27.92%;多态潜能次高的有1 260个,占72.08%.选择整体长度不小于24个碱基的SSR位点用于开发马尾松SSR引物,设计出135对备选引物,最终有51对引物在马尾松中得到扩增,有效扩增率为37.78%;其中39对有多态性,多态率为28.89%.在51对可扩增引物所对应的SSR类型中,P型占74.51%,I型占3.92%,C型占21.57%.