马动脉病毒GL蛋白基因的分子克隆及序列测定

<正>马动脉炎病毒(Equine areritis virus,EAV)是马病毒性动脉炎(equine viral arteritis,EVA)的病原体,由于其能够引起孕马流产、传播快而引起学者们的关注。EAV是套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员,是线性单股正链RNA病毒。EAV含有7个     

编码鸡IL-18成熟蛋白基因的分子克隆与序列测定

白细胞介素18（IL-18）是一种能诱导IFN-γ产生的新型细胞因子，在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用，本研究根据已发表的鸡白介素18（IL-18）cDNA基因序列设计引物，用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术从有丝分裂原ConA刺激48小时活化的白来航鸡脾细胞中扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白质的基因。并进行序列测定。并与结果进行了比较。发现本研究克隆到的鸡IL-18成熟蛋白编码基因序列在482位为C，而Schnieder等报道的序列为T，这一核苷酸序列的变化导致了推导的对应氨基酸残基由苯丙氨酸变为丝氨酸。该处碱基变化的原因究竟是鸡 IL-18本身存在多态性，还是反转录或PCR过程中的碱基错配所致，该处碱基的变化对于鸡IL-18蛋白的表达及其生物活性究竟有无影响等问题正在研究中，该基因为国内首次报道经序列测定证实的鸡IL-18基因，为进一步体外表达鸡IL-18蛋白并深入研究其功能奠定了基础。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的分子克隆与序列测定

将番鸭细小病毒（MDPV）强毒Q株经番鸭胚连续传代，获得致弱株MDPV－26，根据已发表的MDPV的全基因序列，设计了1对引物LHMP7／LHMP8，同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶Sac Ⅱ和KpnⅠ的酶切位点，应用PCR技术扩增了MDPV0－26株的VP2基因片段，将扩增后的基因片段重组到pMD18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，测序结果表明，弱毒株MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列相同率达99．7％，与国外分离株的同源性为98．3％，说明强，弱毒株的VP2基因序列变化不大。     

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.     

马传染性贫血病病毒核心蛋白基因的克隆和表达

根据美国马传染性贫血病病毒（EIAV）Wyoming株基因序列,设计扩增EIAVgag和p26基因的引物,用PCR法能忠实的分别扩增出全长gag和p26基因。经用杆状病毒表达系统对所获gag和p26基因进行克隆和重组,获得了高效稳定表达Gag和p26蛋白的重组杆状病毒（rBVs）。含有gag和p26基因的重组杆状病毒感染昆虫Sf21细胞,经无血清昆虫细胞培养基增殖和纯化,每升培养物能获得2mgCag或12mgp26蛋白。     

山羊KIFI基因分子克隆及序列分析

利用Primer 3.0设计出1对特异性引物F和R,以成年山羊基因组DNA为模板,扩增山羊的KIFI基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化后挑取阳性菌落进行酶切及测序鉴定。结果表明,克隆所得的472 bp序列(GenBank登录号：GQ988385),包括山羊KIFI基因的Exon 1全长、部分5′UTR和部分Intron 1序列。山羊KIFI基因的Exon 1序列编码116个氨基酸,与绵羊、牛、马、人和家鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和84%。KIFI基因部分序列的克隆,为进一步研究KIFI基因多态性与绵、山羊绒用性能间的相关性奠定基础。     

山羊KIFI基因分子克隆及序列分析

利用Primer 3.0设计出1对特异性引物F和R,以成年山羊基因组DNA为模板,扩增山羊的KIFI基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化后挑取阳性菌落进行酶切及测序鉴定。结果表明,克隆所得的472 bp序列(GenBank登录号:GQ988385),包括山羊KIFI基因的Exon 1全长、部分5′UTR和部分Intron 1序列。山羊KIFI基因的Exon 1序列编码116个氨基酸,与绵羊、牛、马、人和家鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和84%。KIFI基因部分序列的克隆,为进一步研究KIFI基因多态性与绵、山羊绒用性能间的相关性奠定基础。     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.     

新城疫病毒B95株HN蛋白基因的克隆及序列分析

根据NDVHN蛋白已知基因序列设计一对引物，以提取的澳大利亚布里斯班NDV分离株B95基因组RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增得到一条约1．9kb的条带。将扩增产物克隆到PGEM—T—easy载体中，并对重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定，结果证明我们得到了HN基因的阳性重组子，随后采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定，获得该基因全长序列，并进行同源性分析。B95株与其他毒株核苷酸同源性为95．1％～87％，氨基酸同源性为96．1％～92．1％。     

绵羊SRY基因的分子克隆及序列分析

本研究利用常规方法提取绵羊基因组ＤＮＡ，根据人的ＳＲＹ基因核心序列设计合成了一对引物Ｐ１、Ｐ２。用ＰＣＲ技术对公、母绵羊基因组ＤＮＡ进行体外扩增，将所扩增出的公绵羊特异性ＳＲＹ基因片段重组到质粒ＤＮＡｐＵＣ１９的ＳｍａＩ部位并转化到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ中。挑选阳性克隆进行微溶分析，并用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ酶解。鉴定结果表明，插入片段长度与ＰＣＲ扩增带相符，约２０３ｂｐ。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧末端终止法测定绵羊ＳＲＹ基因核心序列的部分序列，结果表明，用ＰＣＲ分离并重组到质粒载体中的绵羊ＳＲＹ基因核心序列部分序列长度为２０３ｂｐ，这与设计完全相符。其中该序列的１５５个ｂｐ与人的ＳＲＹ基因相应序列的同源性为８２．５８％（１２８／１５５）。可见哺乳动物ＳＲＹ基因的核心序列具有高度保守性，种间差异很小。     

鸡肿瘤坏死因子α基因片段的分子克隆及序列测定

应用LPS诱生的鸡培养白细胞提取总RNA,参考几种动物的TNFα保守序列设计一对引物,以提取的培养白细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增目的基因片段,将PCR产物与PUC19连接,转化到大肠杆菌DH52进行分子克隆,对提取的重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定,表明重组的基因片段是目的基因片段,其长度为576bp。     

鸡γ-干扰素基因的分子克隆与序列测定

应用逆转录 -聚合酶链式反应 ( RT-PCR)技术 ,从 Con A诱导培养 2 4 h的鸡脾淋巴细胞中扩增得到了大小约 50 0 bp的基因 ,将其平端连接到 p UC1 9质粒上 ,进行质粒 PCR和 Eco RI、Hind 双酶切鉴定后 ,筛选阳性重组克隆。序列分析表明 ,该基因阅读开放框架由 4 92个核苷酸组成 ,与马和人γ-干扰素基因序列的同源性分别为 3 5%和 3 2 %,与鸡 型干扰素基因的同源性仅为 1 5%,与国外报道的鸡 γ-干扰素基因序列完全一致。表明鸡脾淋巴细胞受到有丝分裂原刺激后 ,其 γ-干扰素基因 m RNA发生了表达 ,试验成功地克隆得到了鸡 γ-干扰素基因     

鸡传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白基因(N)的克隆及序列测定

根据IBV病毒已报道基因序列设计了一对用于扩增鸡传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白基因（N）的引物，经RT－PCR得到了预期大小的扩增产物；将目的的条带纯伦并回收以后，克隆到pMD18－T质粒载体中，对插入片段进行序列测定，并与已发表的IBVN基因序列进行了比较和分析，表明具有高度相似性。证明我们克隆了IBVT株的N基因。     

抗猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体重链基因的克隆及序列分析

为获得抗猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(MAb)重链可变区基因,提取MAb杂交瘤细胞8C4总RNA,通过RT-PCR扩增其重链可变区基因。其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列包含CDR1、CDR2、CDR33个高变区,CDR1含GYTFTSYY 8个氨基酸、CDR2含IYPGDGST 8个氨基酸、CDR3含ARVMIAMDY 9个氨基酸。第22位和96位为骨架区的2个半胱氨酸,形成链内特征性二硫键。该序列符合鼠Ig重链基本框架结构,框架区内无终止密码子,为重排产生的序列。本实验获得的重链序列为研制基因工程抗体奠定了物质基础。     

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒Van Roekel(AEV VR)株通过SPF鸡胚传代复壮，获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒1143(AEV 1143)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VPl基因序列，设计了3对引物，分别扩增AEV VR株的VP0、VP3、VP1基因，将RT-PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明，AEVVR株与AEV1143株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为95．1％、93．6％和93．9％；氨基酸的同源性分别为97．57／6、97．5％和99．6％。     

阿留申病毒强致病性毒株非结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据Genbank公布的全基因序列设计两对引物,利用PCR扩增技术,得到阿留申病毒非结构蛋白基因ADV-LN1、ADV-LN2,将其克隆至pMD18-T载体中进行序列测定,并与其它国内外毒株的非结构蛋白进行序列比较和分析。序列分析表明,同国外毒株相比核苷酸序列同源率NS1为87.8%～99.1%,NS2为87.7%～98.5%,NS3为85.4%～99.2%;氨基酸序列同源率NS1为82.5%～98.0%,NS2为81.6%～96.5%,NS3为78.2%～98.9%;与国内毒株相比核苷酸序列同源率NS1为91.5%～93.8%,NS2为93.0%～94.7%,NS3为93.5%～96.6%;氨基酸序列同源率NS1为87.4%～89.9%,NS2为87.7%～90.4%,NS3为88.5%～94.3%。系统进化树分析表明:国内流行毒株之间与欧美毒株之间,差异逐渐缩小,遗传变异趋势更加复杂。     

逆向转运蛋白基因的克隆及序列分析

根据同源序列区域设计简并引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ 及ＲＡＣＥ 方法从盐生植物大叶补血草中分离了Ｎａ^＋／Ｈ^＋逆向运输蛋白基因的ｃＤＮＡ（LgNHX1，ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＥＵ７８０４５７）。LgNHX1的ｃＤＮＡ 全长为２３９７ｂｐ，５′端非翻译区长度为５１２ｂｐ，３′端非翻译区长度为２２９ｂｐ，其中包括１２ｂｐ的ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴，中间的开放读码框为１６５６ｂｐ，编码１个５５０个氨基酸的多肽，推测分子量为６１ｋＤ。氨基酸同源性分析表明，ＬｇＮＨＸ１与北滨藜、小麦、盐角草和拟南芥液泡Ｎａ^＋／Ｈ^＋ 逆向运输蛋白的一致性分别为８２．６２％，８２．０１％，８０．６４％ 和７５．８６％。预测分析表明，ＬｇＮＨＸ１具有１１～１２个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白（ＬｇＮＨＸ１）与液泡型的Ｎａ^＋／Ｈ^＋ 逆向转运蛋白的亲缘关系较近，与质膜型的Ｎａ＋／Ｈ＋ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

鸡IL-2基因的克隆及序列测定

应用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，参照Ｓｕｎｄｉｃｋ发表的鸡白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ基因序列，利用在行设计合成的１对引物，从ＣｏｎＡ活化的５周龄ＨＷＬ－ＳＰＦ鸡脾细胞中，扩增出长４４５ｂｐ的鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因，以ＰＵＣ１１９为载体，克隆了扩增片段，经酶切鉴定及ＤＮＡ序列测定，确认为鸡ＩＬ－２基因，该序列与Ｓｕｎｄｉｃｋ报道的结果一致。对氨基酸的比较发现，鸡ＩＬ－２与牛ＩＬ－２