墨兰ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立墨兰的ISSR-PCR反应体系,采用正交试验分析了5个因素（Tag酶浓度、Mg2＋浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度）在4个水平上对 ISSR -PCR反应的影响。结果表明：Tag 酶浓度为1.6U/25μL、Mg2＋浓度为2.4mmol/L、dNTP浓度0.96 mmol/L、Primer浓度为0.64μmol/L、DNA 浓度3.2ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。     

刨花润楠SRAP-PCR体系建立与优化

以刨花润楠(Machilus pauhoi)1.5 a生小苗幼嫩叶片为试材,对影响刨花润楠SRAP-PCR扩增的模板DNA量、引物、dNTP和Mg2+体积摩尔浓度、Taq DNA聚合酶、退火温度6个主要因素进行优化.结果表明,SRAP-PCR的最佳反应体系为:25μL的SRAP-PCR反应体系中,2.5μL 10×PCR buffer、模板DNA量60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.225 mmol/L、引物0.3μmol/L和Taq DNA聚合酶1.25 U.对优化的反应体系和扩增程序的验证结果表明,优化的刨花润楠SRAP-PCR反应体系和扩增程序是稳定可行的.     

南酸枣ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以南酸枣叶片基因组DNA为模板,采用单因子实验方法对影响ISSR反应体系的dNTP、Mg2+、引物浓度、模板DNA、Taq酶等5个因子进行优化,结果表明,在20 L ISSR反应体系中,各反应物的最适含量为：2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、0.25～0.5 mol/L引物、20 ng DNA和0.5 U Taq聚合酶。利用该优化体系扩增85条ISSR引物,有65条有扩增产物,38条具有多态性,并且利用842引物扩增不同南酸枣DNA模板,扩增的目的条带清晰、多态性好、稳定性强,可以用于后期的南酸枣种质资源鉴定及遗传多样性研究。     

刚竹ISSR反应体系的正交优化

采用正交设计的方法,对刚竹ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶、Mg2 、dNTP、模板DNA和引物)4个水平进行优化筛选,建立了刚竹ISSR-PCR反应的最佳体系,即20μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.5 U、Mg2 2.5 mmol.L-1、模板DNA 80 ng、dNTP 0.15 mmol.L-1、引物0.4μmol.L-1;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。     

锥栗SRAP反应体系的建立与优化

为了建立锥栗SRAP-PCR反应体系,从而为今后的锥栗分子生物学研究提供理论参考,以锥栗叶片基因组DNA为材料,采用单因素试验和正交试验相结合的研究方法,对影响锥栗SRAP-PCR反应体系的模板用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度这5个主要因素进行了优化试验。试验确立的适合锥栗的SRAP-PCR反应体系为:20μL体系中,模板DNA用量为40 ng,Mg2+浓度为1.8 mmol/L,dNTP浓度为280μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为2.0 U,引物浓度为0.6μmol/L。     

马尾松胚乳DNA高效提取及SSR-PCR体系优化

以马尾松胚乳为试验材料,用CTAB-SDS法提取单粒胚乳DNA,对其浓度和纯度进行检测。结果表明:运用CTAB-SDS法提取的马尾松胚乳DNA浓度高、纯度好,琼脂糖凝胶电泳条带清晰,点样孔干净。此外,还对影响PCR结果的Mg2+、dNTP、模板DNA、引物浓度、TaqDNA聚合酶5个因素进行了正交设计试验,建立了适合马尾松SSR-PCR的反应体系:即在10μL反应体系中,Mg2+浓度为2.80 mmol/L,dNTP浓度为0.35 mmol/L,引物浓度为0.075μmol/L,模板DNA浓度为20 ng/10μL,TaqDNA聚合酶浓度为0.50 U/10μL。     

葡萄SSR反应体系的优化

以葡萄新鲜幼嫩叶片为材料,研究了SSR分析过程中的影响因素,包括Taq酶、Mg2 、dNTP、引物、模板DNA浓度、退火温度等,建立了适合葡萄SSR反应的PCR体系,即20μl反应体系中含有Taq酶1.0 U、Mg2 浓度为1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.5μmol/L,模板DNA20~30 ng。扩增程序为:95℃预变性4 min;95℃变性50 s、50~60℃退火1 min7、2℃延伸1 min 30 s,30个循环;最后72℃延伸7 min。     

七叶树RAPD反应体系的优化

以七叶树新鲜叶片为材料,研究了七叶树RAPD分析过程中的影响因素包括Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合七叶树RAPD反应的PCR体系。即20μl反应体系中含有dNTP 0.25 mmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.8μmol/L,DNA模板50ng。扩增程序为:94℃预变性5min,然后40个循环(94℃变性30 s,33℃退火40 s,72℃延伸60 s),最后72℃延伸10min,4℃保存。     

云南金花茶SSR-PCR反应体系的建立与优化

以云南金花茶为试验材料,利用试剂盒法、SDS法及CTAB法3种方法提取其DNA,并对3种方法的提取结果进行比较;经初筛合成云南金花茶EST-SSR引物,并对影响SSR-PCR体系的Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物及模板DNA这5个因素进行L_(16)(45~)正交实验,以期建立较为稳定的云南金花茶SSR-PCR体系。试验结果表明:试剂盒法提取得到的云南金花茶DNA质量最好且符合SSR分子标记试验。各因素对PCR扩增效果的影响程度为:Mg2+引物 Taq DNA聚合酶 dNTP模板DNA。试验最终确定的金花茶SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为:2.0μL Taq Buffer、1.5μL Mg2+(25 mmol/L)、0.3μL dNTP(10 mmol/L)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、前后引物各0.4μL(10μmol/L)、0.5μL模板DNA(50 ng/μL)、14.7μL ddH_2O。建立和优化云南金花茶SSR反应体系,可为云南金花茶不同种群的遗传变异研究提供基础。     

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2 浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2 1.8 mmol/L、1×Buffer 2 μL、dNTP0.2 mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10 ng/μL.扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性40 s,52℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,共39个循环;72℃完全延伸5 min,4℃保持.该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件.