DHAR基因植物表达双元载体的构建及转化百合研究

将质粒pSB166中包含ED35s肩动子,Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303,构建了中间表达载体,将DHAR基因与pCSB定向连接,构建了DHAR基因植物表达载体pCSB-DHAR.进而以百合叶片为受体,通过根癌农杆菌介导的方法将DHAR基因转入百合,对转基因百合进行PCR检测,初步表明DHAR基因已整合到百合基因组中.     

蚯蚓MT基因植物表达载体的构建及烟草转化

为了提高植物对重金属的耐受力和富集能力,从而减少重金属对土壤的污染,本研究将克隆的赤子爱胜蚓(Eiseniafoetia)MT基因,装入植物表达载体pPZP111,构建了植物表达载体pPZP-efMT。然后用三亲法将其导入根瘤农杆菌EHA105中,通过叶盘法转化烟草。经PCR检测,efMT基因已整合到烟草基因组中,为进一步验证转基因烟草的抗重金属能力奠定了基础。     

农杆菌介导的抗菌肽基因SPCEMA对马铃薯的遗传转化

为了得到马铃薯抗病材料,本研究利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404转化马铃薯栽培品种“台湾红”,建立了优良的遗传转化系统:根癌农杆菌浓度以D600nm=0.5￣0.8为宜,感染时间以5min为宜;茎段和叶盘的预培养时间分别以4d和8d为宜,共培养时间皆以3d为宜。通过PCR和Sourhernblotting检测证明抗菌肽基因SPCEMA已成功导入其中。其茎段和叶片为的转化频率分别为10%和5.79%。     

白藜芦醇合酶基因表达载体构建及对马铃薯的遗传转化

利用从葡萄中克隆到的白藜芦醇合酶基因(Resveratrol Synthase,简称RS)构建了含有35S组成型启动子的植物表达载体P35s-2300-RS,应用农杆菌介导方法对马铃薯品种进行遗传转化.通过对抗性芽、生根、再生植株的筛选,得到5株再生小苗.经PCR、Southern检测证实,有3株为真正的转基因植株.     

Cry2A基因植物表达载体构建及其转化子生长曲线的建立

根据定向克隆原则,以pCAMBIA2301为载体骨架,Cry2A基因为目的基因,构建了大小为15354 bp的植物表达载体p2AST2301。新载体带有抗虫基因Cry2A和筛选标记基因NPTⅡ,适合通过农杆菌进行遗传转化,并以抗生素G418为筛选底物。同时将新载体转化根癌农杆菌EHA105,获得了用于植物遗传转化的工程菌,并且明确了工程菌D600 nm值在1.0-1.6之间活力最强。     

超级稻DAD1基因正反义植物表达载体的构建及转化菊花的研究

将水稻DAD1基因插入Ti质粒,构建成该基因的正反义植物表达载体pWM-DAD1,pWM-antisense DAD1,转入根癌农杆菌LBA4404后,利用农杆菌介导的叶盘法转化菊花,经Hyg抗性筛选,并诱导愈伤组织和分化成苗,得到转基因菊花植株,通过PCR检测,从部分转基因植株中检测出预期的目的基因的存在.     

水苏糖合成酶基因重组载体的构建及转化农杆菌

以黄瓜叶片中提取的总RNA为模板,经PCR扩增得到长度为1 275bp的基因片断,经过酶切测序之后,将目的基因连接到表达载体,构建成重组质粒。再利用液氮冻融法将表达载体转化农杆菌感受态。     

根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化条件的优化

利用山东省广泛栽培的马铃薯品种为材料，对影响马铃薯遗传转化的抗生素浓度、农杆菌浓度、预培养时间和共培养时间等进行了研究。结果表明：（1）卡那霉素Km浓度以15－25mg/l作为马铃薯叶圆片转化时的选择压更合适；（2）羧苄青霉素（Cb）比头孢霉素Cefo更适合用于农杆菌介导的马铃薯叶圆片的遗传转化；（3）外植体预培养时间4d，共培养时间3d为最好；（4）菌液浓度以OD600＝0.5左右最好。上述条件的优化大大提高了马铃薯遗传转化效率。     

野生型根癌农杆菌对马铃薯的遗传转化研究

用不同的野生型根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T37、B6、TFA16YET、FA16YK对马铃薯普通栽培种甘农薯1号的块茎圆片、茎段、叶切片、试管苗,美国引进品种褐皮.布尔班克的块茎圆片以及新型栽培种NW-174实生苗的子叶及下胚轴等组织进行了离体侵染和整株侵染实验,发现:不同的菌种对同一组织以及相同的菌种对不同组织的侵染效果均不同。在供试菌株中,以TFA16YE的转化效果最好。对NW-174新型栽培种实生苗的子叶、下胚轴进行的侵染实验表明,这两种组织的转化率较高。结果表明,在离体转化程序中,外植体的生理状态、发育阶段以及供试菌株的代谢活性及培养条件等均是影响转化效率的重要因素。     

LeJA2基因沉默表达载体导入番茄转化系统的建立

试验设侵染时间、菌液浓度和侵染温度3个因素,利用根癌农杆菌将LeJA2基因按L9（3^4）正交表转化番茄。结果表明,当菌液浓度为OD260=0．6、侵染温度40℃、侵染10min时的转化效果较好,从而建立了较优的LeJA2基因沉默表达载体导入番茄的转化体系,并已得到14株转化再生的番茄植株,经卡那抗性筛选和PCR检测,证明LeJA2-RNAi基因已导入番茄并表达。     

根癌农杆菌介导马铃薯遗传转化的研究进展

植物基因工程是马铃薯遗传改良的重要技术之一。根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化法是目前广泛采用的转基因方法,具有操作简便、低拷贝等优点。该研究综述了根癌农杆菌介导马铃薯遗传转化的分子机制及过程、再生体系、影响因素等,并对进一步的研究做出了展望。     

小菊'类锌指蛋白'基因植物表达载体构建及对烟草的转化

为了建立耐盐碱小菊(Chrysanthemum morifolium)中克隆到的'类锌指蛋白基因'CmSTZF(DQ864730)的烟草遗传转化体系,并研究其抗逆特性。本研究借助Gateway技术构建了小菊'类锌指蛋白'基因CmSTZF的过量表达载体pH7WG2D-CmSTZF,并以烟草NC89(N.plumbaginifolia'NC89')的叶片为试材,通过农杆菌介导的转化,成功地建立了烟草遗传转化体系,经PCR-Southern鉴定获得CmSTZF的转基因烟草株系。     

农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化体系优化研究

以甘肃主栽品种的茎段为外植体,研究了不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对转化效率的影响,以及选择压和培养基对抗性出芽的影响,初步建立了马铃薯品种“陇薯3号”和“台湾红皮”的遗传转化体系并获得了转化植株。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果表明,再生的转化植株假阳性率比较高,要获得预期的转基因植株群体需加大遗传转化工作中转基因植株的数量。     

菜豆几丁质酶基因转化马铃薯及后代表达

通过农杆菌侵染和原生质体直接转化法把菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯加工品种大西洋中,获得了13株转化后代,经过PCR分析和Southernblot分析,在5株后代中扩增出900bp目标带,说明菜豆几丁质酶基因已整合到马铃薯四倍体基因组中。RT-PCR分析结果表明,其中的3株叶片中有菜豆几丁质酶基因的表达,而且抗病试验进一步证明了该基因在叶片中有较强的表达强度,转基因植株的抗病性比对照提高了30%以上。     

过敏反应促进蛋白基因hrap转马铃薯的研究

利用根癌农杆菌介导法,将由甜椒中分离出的一种过敏反应促进蛋白hrap基因导入马铃薯品种"Russet Burbank"和"大西洋"中。转化再生植株经过含卡那霉素培养基的生根筛选、PCR检测、Southern杂交鉴定表明目的基因已导入马铃薯品种中,RT-PCR检测结果表明目的基因已整合到马铃薯DNA中并表达。通过对转基因植株进行活体接种抗病性检测,获得了抗晚疫病和抗青枯病的植株。     

苹果叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选

以苹果品种嘠拉试管苗为试材,研究了卡那霉素(Km)、潮霉素(Hm)对继代苗生长和离体叶片再生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)对苹果离体叶片再生的影响及对农杆菌EHA105和LBA4404的抑菌效果;以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。结果表明:Km10mg/L、Hm4.0mg/L完全抑制了叶片不定芽的分化,可作为苹果叶盘法转化时抗性芽的选择压;Km50mg/L、Hm5.0mg/L达到继代苗的半致死浓度,可作为转化后抗性苗的筛选浓度;由于抗性芽再生的选择压与抗性苗筛选浓度相差较小,Hm相对于Km更适合作为苹果基因转化的选择标记;培养基中附加Cef300mg/L能完全抑制农杆菌生长,对叶片不定芽的再生影响不大;而附加Carb则需400mg/L以上才能抑制农杆菌生长,同时严重抑制了叶片再生。因此,宜选用Cef作为苹果基因转化的抑菌抗生素。     

AP70抗病基因转化番茄的研究

[目的]通过基因工程提高番茄抗病性。[方法]通过冻融法将含萝卜抗真菌蛋白基因的质粒AP70转入农杆菌LBA4404中,再用农杆菌介导法将AP70抗病基因对番茄进行遗传转化,研究预培养、侵染时间等因素对AP70转化番茄的影响。[结果]带柄子叶诱导番茄产生不定芽的效率比子叶块效率高。农杆菌浸染番茄子叶前预培养1 d,不仅能提高子叶存活率,而且可降低共培养时外植体的污染率。农杆菌对番茄子叶的侵染时间最好不超过5 min。外植体筛选培养基中Kam的浓度不宜太高或太低,可获得少量转AP70基因的抗性芽。[结论]农杆菌对番茄子叶侵染前要进行稀释,且侵染时间不宜超过5 min,共培养1 d时转化率较高。