阿维菌素Bla组分高产菌株的高通量选育

为筛选阿维菌素高产菌株,建立了阿维菌素高产菌株的高通量初筛及复合诱变技术选育高产菌株的方法.初筛首先采用24孔板培养突变株,发酵培养5 d,甲醇直接浸提固体培养物,最后利用96孔板-酶标仪检测浸提液在紫外波段245 nm吸收.以阿维链霉菌(Streptromyces avermitilis)编号为AV-X-95的阿维菌素产生菌作为出发菌株,通过紫外线(UV)照射45 s和亚硝基胍(NTG)处理60min的组合诱变方法对出发菌株的孢子悬液进行了连续的诱变处理.研究结果表明,1 728株突变子的经高通量初筛后得到8株高产菌株,经摇瓶复筛和稳定性考察得到高产菌株AW4-329,其Bla产量较出发菌株提高了15.1%.     

产谷氨酰胺转胺酶菌株的高通量筛选

【目的】用醋酸纤维素膜和96孔板2种方法高通量筛选高产谷氨酰胺转胺酶(MTG)的茂原轮枝链霉菌菌株。【方法】利用紫外诱变获得茂原轮枝链霉菌突变体库后,分别利用醋酸纤维素膜和96孔板2种方法高通量初筛产MTG菌株,然后依次用试管和摇瓶发酵法复筛,并对96孔板高通量筛选方法的条件进行了优化。【结果】利用醋酸纤维素膜显色法从3 000株紫外诱变的菌株中筛选出1株高产MTG茂原轮枝链霉菌,其MTG活性为4.9U/mL,较出发株(MTG活性2.7U/mL)提高了80%。优化的96孔板高通量筛选方法为:直径为3mm左右的单菌落接种至150μL发酵培养基中,30℃200r/min培养72h;利用该法从3 415株紫外诱变的菌株中筛选获得了2株MTG高产株,其MTG活性为5.4U/mL,较出发株(MTG活性为3.0U/mL)提高了80%。【结论】利用基于醋酸纤维素膜和96孔板的2种高通量筛选方法分别筛选到1株和2株高产MTG的茂原轮枝链霉菌;相较传统的选育方法,这2种高通量筛选方法都大大降低了经济成本,提高了筛选效率,缩短了选育周期。     

黑曲霉高产纤维素酶菌株的高通量筛选

以黑曲霉GSICC 60108为出发菌株,经紫外和电子束诱变处理后,采用纤维素-刚果红平板初筛和新建立的高通量微孔板法进行复筛以获得高产纤维素酶菌株.结果表明:试验得到1株稳定高产的纤维素酶菌株黑曲霉EBR-106;所建立的复筛方法的标准曲线在葡萄糖质量浓度为0～10 mg/mL的范围内线性良好(r=0.999 75)...     

高通量法选育果胶酶高产菌株

用深孔微培养-酶标仪检测替代摇瓶培养-紫外分光光度计检测,以期建立1种高通量选育果胶酶高产菌的方法。试验确立的最佳微培养条件为:转速280 r/min,振幅45 mm,装液量1.2 m L/孔。经统计软件分析表明:2种检测方法的检测值、酶产值间线性回归关系均极显著,且数值排序大致相同,表明用深孔微培养-酶标仪检测体系选育菌种是可行的。通过复合诱变(超声波处理40 min,紫外照射60 s),经过高通量筛选,得到4株高产菌。经传代培养后证明:C23-7、C23-9这2株菌遗传稳定,酶活效价均值分别可达705.7、695.0 U/m L,分别比出发菌株(477.3 U/m L)提高了47.85%、45.61%,适合应用。     

一种快速微量化测定蛋白质谷氨酰胺酶活性的方法及其初筛应用

通过对苯酚-次氯酸盐法(试管体系)反应体系微量化,借助酶标仪动态检测96孔板中蛋白质谷氨酰胺酶与底物产生氨的最大速度Δmaxv,对于不同浓度的标准PG样品与不同酶活的发酵液,Δmaxv与酶活间呈显著正相关(r=0.999、r=0.890),故用Δmaxv代替酶活进行快速测定。选用96孔板作为快速测量体系,标准PG样品与发酵液在96孔板内部60孔中Δmaxv变异系数分别为10%、18%。利用该方法进行亚硝酸钠(nitrite,NIT)诱变初筛,0.6 mg/m L的NIT处理10~9CFU/m L菌液20 min,涂板后筛选400株菌株样本,利用该方法最终得到1株是出发菌株酶活1.825倍且稳定性良好的菌株,可继续作为出发菌株应用于后续诱变筛选工作中。该方法可以准确、快速地提高诱变初筛的效率,为以后的育种工作奠定了基础。     

基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1 152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%～15%增加至30%～35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl1215-5和Gen1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。     

阿维菌素高产菌的诱变育种研究

[目的]选育B1a组分较高的阿维菌素高产菌株。[方法]通过紫外线-氯化锂(LiCl)和紫外线-亚硝基胍(NTG)对阿维链霉菌N-5-6进行了复合诱变处理。[结果]以1.00 mol/L的LiCl和60s的紫外线照射时间以及以45 s的UV照射时间和0.8 mg/ml的NTG浓度分别对出发菌株进行复合诱变处理,通过筛选得到13株总效价比出发菌株提高了20%以上的突变株,经HPLC检测,其中7株B1a组分含量较高,均在45%以上。菌株H02180的B1a含量达到了51.35%,比出发菌株N-5-6的B1a含量提高了65.1%;菌株H02108的B1a含量达到了51.26%,比出发菌株N-5-6的含量提高了64.8%。[结论]采用紫外线和氯化锂、紫外线和亚硝基胍这2种复合诱变方法对于阿维链霉菌的高产菌株的选育是有效的。     

高产果胶酶的黑曲霉化学诱变选育

以黑曲霉(Aspergillus niger) HY - D3为出发菌株,采用化学试剂甲基磺酸乙酯(EMS)进行诱变处理,以获取果胶酶高产突变菌株.首先使用透明圈法进行初筛,选育出透明圈与菌落直径比值有大幅提高的突变株,然后采用固体发酵法进行复筛,最终筛选出1株高产果胶酶的突变株HY - M27.HY - M27经过连续5代的斜面培养,产果胶酶遗传特性稳定,其酶活力达到了2290 U/g以上,比出发菌株提高了2.91倍.     

化学诱变选育高产纤维素酶菌株

[目的]研究化学诱变剂对高产纤维素酶生产菌的选育。[方法]以1株绿色木霉(Trichoderma virideF1)为出发菌株,经过亚硝基胍、硫酸二乙酯和氯化锂诱变处理,选育纤维素酶高产菌株生产菌。[结果]经LiCl诱变后,得到1株产酶活力较高的菌株L6,相对酶活较出发菌株提高了35.7%。[结论]化学诱变是诱变微生物、筛选优良菌株的有效手段。     

以脂肪酶活为指标快速筛选吉他霉素高产菌株的研究

[目的]筛选吉他霉素高产菌株。[方法]以1株北里链霉菌Zn14-05为出发菌株,进行紫外线与NTG复合诱变处理,通过以脂肪酶活力为初筛指标和摇瓶复筛筛选吉他霉素高产菌株。[结果]摇瓶发酵效价比出发菌株提高10%;传代试验结果表明其遗传性能稳定。[结论]以高脂肪酶活性为初筛指标选育吉他霉素高产突变株,缩短了选育周期,减少了初筛工作量,提高了选育效率。     

两点法电位检测储罐底板阴极保护效果评价

针对深井阳极对储罐底板阴极保护数值模拟中存在的缺陷,提出了一种根据典型电流密度分布假设求解保护电位的方法.根据阴极保护体系物理模型,近似计算了深井阳极极化电位,数值计算结果与现场实测电位数据的对比结果验证了数值方法的可靠性.通过计算,确定了单支深井阳极完全有效保护的临界储罐直径.根据数值计算结果,提出了两点法的电位检测储罐底板阴极保护效果评价技术.     

阴极保护系统在罐区和长输管道中的应用

对仪征输油站区域性阴极保护进行试验,分别采用了垂直深井阳极对罐区进行外加电流阴极保护和浅埋阳极对储罐进行保护两种方法,并将这两种阴极保护效果进行了对比.试验证明,这两种方法都能使储罐底板下表面得到有效的阴极保护,垂直深井阳极地床的保护电位更加均匀.并针对已建和新建储罐的阴极保护措施提出了建议.     

气相色谱法检测宁夏枸杞中联苯菊酯残留量

以宁夏中宁枸杞为研究对象,建立了检测枸杞中联苯菊酯残留量的毛细管气相色谱法.试样用乙腈提取,过CARB/NH2固相萃取柱,经丙酮/二氯甲烷净化洗脱,再过Florisil柱,经正己烷/二氯甲烷淋洗除杂,乙酸乙酯洗脱,正己烷定容,采用DB-1701毛细管色谱柱分离,GC-ECD进行分析.结果表明,中宁枸杞中联苯菊酯含量为0.002 2 μg/g,RSD为3.55％,样品加标回收率为92.47％,RSD为1.70％.该方法简便、快速、灵敏、准确,符合农药残留分析要求,研究结果为枸杞质量控制提供了一定的参考价值.     

重庆春大豆区试平移乘积模型分析

[目的]找到具有适应性广、高产、稳产的品种和具有较好代表性的区试试点。[方法]采用平移乘积（SHMM）模型分析方法对2009年重庆市春大豆区域试验进行分析。[结果]大豆品种长江春1号属于高产稳产性品种,秋毛大豆属于低产不稳定品种,其余包括对照在内的所有品种稳定性参数欧氏距离（Dg）都在6.13~7.13。辨别能力最强的试点是梁平,其次是北碚,辨别能力最差的试点是巴南。[结论]研究结果为重庆市大豆生产提供了一定的参考依据。     

枸杞果醋加工工艺研究

[目的]为科学利用枸杞提供依据。[方法]以枸杞鲜果为原料,经液态深层发酵,即酒精发酵和醋酸发酵制造果醋饮品,并对发酵工艺参数进行优化。[结果]酒精发酵周期为6 d,醋酸发酵周期为9 d。经过正交试验确定酒精发酵最佳工艺组合为:糖含量12%,酵母接种量0.2%,发酵温度30℃;醋酸发酵最佳工艺组合为:初始酒度6%,发酵温度30℃,摇床转速180 r/min。经发酵后熟、过滤澄清、灭菌装瓶后可酿制出色泽紫红、果香突出、品味柔和的高档次枸杞保健果醋。[结论]经该工艺制得的枸杞果醋风味纯正,并具有水果香味,是一种价值较高的营养保健型饮品。     

苹果褪绿叶斑病毒的分子杂交检测

[目的]探索检测苹果褪绿叶斑病毒的技术体系。[方法]利用CTAB法提取感病苹果叶片总RNA,以总RNA为模板,利用特异性引物,建立利用cDNA探针检测苹果褪绿叶斑病毒的技术体系。[结果]扩增出了预期片段,经克隆、测序证明该片段为苹果褪绿叶斑病毒的特异性片段。以带有特异片段的质粒为模板,利用PER技术制备出地高辛标记的cDNA探针。[结论]以质粒为模板可高效制备大量探针。地高辛标记探针为非放射性标记探针,安全性较好,灵敏度较高,具有重要的应用价值。     

胡萝卜抗冻蛋白基因克隆及植物表达载体构建

以胡萝卜品种 Autumn King的幼苗为材料 ,用 CTAB法提取其基因组 DNA,以 PCR ( Polym eraseChain Reaction)的方法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因 ( afp) ,以 p UCm - T Vector为载体构建成胡萝卜 afp的克隆载体 p TAF,用 Eco R 消化重组质粒 p TAF使其线性化 ,再用 DNA聚合酶 Klenow大片段补平末端 ,然后用Xba 消化 ,获得一末端粘 ,一末端平的目的片段 ( afp)。植物表达载体 p BI12 1用 X ba 和 Sma 双酶切 ,获得一末端粘 ,一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在 T4DNA连接酶的作用下进行定向连接 ,构建成胡萝卜 afp的植物表达载体 p BAF     

叶面喷施硒肥对烤烟的影响

通过大田叶面喷施硒肥试验,研究了硒肥对烤烟生长、叶绿素含量、烟叶硒含量等的影响。结果表明：硒肥有促进烟株生长的作用,施用硒肥时间越早,促进作用越大。第5叶的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a＋b、类胡萝卜素含量,喷施硒肥的处理极显著大于对照;第10叶的叶绿素a含量喷施硒肥的处理显著大于对照;第14叶的叶绿素a含量喷施硒肥的处理显著小于对照。喷施硒肥时期越迟,叶片平均硒含量越高。叶面喷施硒肥的利用率为1.41%-3.27%,平均为2.37%。     

烟叶中钾含量变化规律研究

[目的]为培育优质烟叶提供理论依据。[方法]以烤烟烟叶(K326)为试材,样品烘干磨碎、溶解、过滤、定容后,用火焰光度计测定钾含量。[结果]一昼夜中烟叶含钾量呈周期性变化,以12:00最高,18:00最低。不同生育阶段的烟叶中钾含量存在较大差异并随植株生长而降低。第1次取样的烟叶钾含量最高,以后各生育阶段逐渐下降。在正常生长条件下,不同部位的烟叶含钾量随叶位升高而降低。钾含量是植株下部叶最高,中部叶较次,上部叶最低。3个部位烟叶的钾含量差异极显著。同一叶不同部位的烟叶含钾量规律为叶基部>叶中部>叶尖部。[结论]烟叶中的钾含量存在很大规律性,不同位置的烟叶钾含量不同。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1 088 bp,其中ORF 771 bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80 kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。