兔出血症病毒VP60主要抗原表位基因的克隆及表达

兔出血症（rabbit haemorrhagic disease,RHD）是1984年由我国首先发现的家兔的一种烈性毁灭性病毒性传染病。迄今为止,本病在世界范围内广泛流行。由于RHDV在体外组织细胞的培养方法尚未建立,所以目前广泛使用的疫苗为组织灭活苗。这种疫苗不仅具有其自身所不可避免的种种缺陷,并且随着非免疫兔的急剧减少,组织灭活苗的成本不断增加。因此,RHDV惟一的结构蛋白-VP60的研究成为热点。VP60基因在病毒诱导机体的免疫反应中起主要作用,其核苷酸的极端保守性正是目前RHDV仅有一个血清型的原因所在,     

兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用

VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。     

兔出血症病毒VP60蛋白研究进展

兔出血症是由兔出血症病毒引起的一种发病率高、致死率高的烈性传染病,以肝坏死和肺出血为典型组织病变。兔出血症病毒VP60蛋白是该病毒主要的结构蛋白和免疫原性蛋白,能够诱导机体发生免疫应答,产生保护性抗体,因此关于该蛋白的结构、表达及功能是研究该病毒的一个重要内容。本文综述了国内学者近几年关于VP60蛋白的基因、表达和变异研究进展情况,希望能为兔出血症病毒研究提供参考。     

兔出血症病毒JL株分离鉴定及VP60基因主要抗原表位分析

采用血凝试验、电镜观察、RT－PCR方法分离鉴定了1株JL株兔出血症病毒（RHDV）,扩增衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMDl8－T载体上,经酶切鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1740bp,编码580个氨基酸;JL株与其他RHDV分离株比较,核苷酸同源性为93．7％－99．2％,氨基酸同源性在97．3％－99．5％,在VP606个区中,A、B、D、F是稳定区,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;将JL株与国内外标准株蛋白氨基酸变畀及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行比较分析,预测RHDV VP60细胞表位。     

兔病毒性出血症病毒 VP60蛋白基因研究进展

兔病毒性出血症病毒（RHDV）是引起兔病毒性出血症（RHD）的病原,严重威胁着世界养兔业的健康发展。在RHDV的感染和免疫研究方面,RHDV 的衣壳蛋白VP60作为具有重要免疫原性的主要结构蛋白备受关注,论文对V P60蛋白基因的结构特征、核苷酸变异情况及在诊断方法建立和疫苗预防研究等方面进行了综述,为RHDV防控相关研究提供有用的参考资料。     

猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为39.1KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析,表达量约占菌体蛋白的65.2%。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该种蛋白能与阳性血清发生特异性反应。结果说明,该重组蛋白具有抗原性,可以作为鉴别诊断用抗原。     

兔出血症病毒VP60蛋白真核表达及其免疫原性研究

将兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA-VP60,并将其转染Vero细胞.间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测pcDNA-VP60在细胞中的表达情况,同时将pcDNA-VP60免疫实验兔,观察血清中特异性抗体变化情况.试验结果表明,本文构建的pcDNA-VP60不仅能在Vero细胞中表达VP60蛋白,而且能够诱导机体产生免疫应答.     

兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人O型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV(AV33)抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株(RHDVa),与RHDV1和RHDV2VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%～97.6%和81.1%～81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%～98.3%和87.4%～87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。     

兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD₅₀测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV （AV33）抗血清抑制,该毒株的LD₅₀为10^-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740 bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株（RHDVa）,与RHDV1和RHDV2 VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%~97.6%和81.1%~81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%~98.3%和87.4%~87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta （DE3）中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74 ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及活性鉴定

为制备兔出血症病毒VP60单克隆抗体,利用HEK293T细胞瞬时表达VP60,免疫Balb/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选获得阳性克隆细胞株-5D11。利用血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)和Westernblot等方法对5D11分泌的单克隆抗体活性进行鉴定,并对其识别区域进行了定位。结果显示,5D11能抑制病毒凝集人“O”型红细胞,与杆状病毒表达的VP60蛋白发生特异性抗原抗体反应,且其识别VP60蛋白线性抗原表位,并定位于494aa-579aa区段。成功制备了抗VP60蛋白单克隆抗体,为开展病原学检测、流行病学研究等奠定了基础。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及活性鉴定

为制备兔出血症病毒VP60单克隆抗体,利用HEK293T细胞瞬时表达VP60,免疫Balb/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选获得阳性克隆细胞株-5D11。利用血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)和Westernblot等方法对5D11分泌的单克隆抗体活性进行鉴定,并对其识别区域进行了定位。结果显示,5D11能抑制病毒凝集人“O”型红细胞,与杆状病毒表达的VP60蛋白发生特异性抗原抗体反应,且其识别VP60蛋白线性抗原表位,并定位于494aa-579aa区段。成功制备了抗VP60蛋白单克隆抗体,为开展病原学检测、流行病学研究等奠定了基础。     

与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用蛋白的初步鉴定

为获得与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)相互作用的细胞蛋白,本研究以pMD-VP60重组质粒为模板扩增RHDV的VP60基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-VP60,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达GST重组蛋白(rVP60),western blot分析表明该蛋白具有与VP60单克隆抗体(MAb)良好的反应原性。以亲和层析纯化的rVP60进行pull-down实验,从兔的肝脏细胞膜蛋白中获得与VP60相互作用的蛋白,多肽质量指纹图谱分析表明,其相互作用的蛋白为ATP合成酶β亚基,提示该蛋白可能与RHDV的感染相关。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选

为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞.以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆.测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等.本研究鉴定的与RHDV VP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础.     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备

构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导5 h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42 ku。蛋白质纯化后,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白质的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1∶1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白质发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒，提取病毒总RNA，以RT－PCR方法扩增得到RHDV VP60基因全长片段，克隆到T载体中，经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行3次测序，测序结果已输送到GeenBank中（注册号为AF453761）。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明：各毒株间核苷酸的同源性为91％－98％，氨基酸同源性为94％－99％，氨基酸变异多发生在高变区，进一步证明了毒株的高度保守性，为明确我国RHDV地方株VP60蛋白的分子特征、分子诊断试剂及新型疫苗的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白A-D抗原表位区的原核表达与蛋白纯化

为制备具有活性的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒包被抗原,本研究将猪瘟病毒E2蛋白主要抗原表位区A-D部分基因插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-E2AD,将其转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。对IPTG浓度和诱导时间进行优化,确定在37℃条件下、IPTG终浓度为0.2 mmol/L时诱导表达4 h,E2AD蛋白的表达量最高。通过对包涵体的纯化条件进行摸索,最终获得目的蛋白的浓度为0.2 g/L。Western blot分析结果显示,E2AD蛋白能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2AD蛋白具有良好的反应原性。该结果为进一步开展猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的研制工作奠定了基础。     

基于兔出血症病毒衣壳蛋白优势抗原区的间接ELISA方法建立

为建立一种检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A（31～250 aa）和B（470～579 aa）两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a（＋）,转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物（AB）的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区（AB）,重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。     

含兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的兔三联灭活疫苗的研究

为研究兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白形成的病毒样颗粒联合多杀性巴氏杆菌(Pm)、产气荚膜梭菌(Cp)的免疫效果,将3种抗原与铝胶佐剂混合制成三联灭活疫苗,进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究.结果表明,3批疫苗以4.0 mL/只免疫兔未见任何不良反应;对兔的最小免疫剂量为1.0 mL/只,免疫后14日,...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位区基因克隆、分析及原核表达

从患流行性腹泻的病猪小肠中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),设计一对引物用于扩增PEDV S蛋白的抗原表位区,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET32a-PEDV-S1;在IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,Western blotting鉴定,结果表明该抗原表位区蛋白得到了重组表达.该研究可为PEDV抗原表位区的相关研究提供参考.     

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板，设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增，获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段，BamHⅠ／HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c，获得重组质粒分别命名为pET32c—HNa、pET32c-HNb和pET32c．HNa—L—b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，筛选出阳性克隆，诱导表达并取产物进行分析。结果表明，HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。