人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究

利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin),gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202,通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗,将外源gna基因导入到3个高产小麦(TriticumaestivumL.)品种中,获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证,确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明,小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集,并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphumpadi)试验,蚜口密度抑制率从19%～73%不等,部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中,并可有效地增强小麦的抗蚜能力,为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。     

小麦转基因株系中外源脂氧合酶抑制基因(Loxi)拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其遗传稳定性及自身表达水平的重要因素。本研究旨在对转外源种子脂氧合酶基因的RNAi序列(RNAi sequence of lipoxygenase gene,Loxi)的小麦(Triticum aestivum)转基因株系中外源基因拷贝数及其种子脂氧合酶活性进行测定分析,以期获得种子脂氧合酶活性显著降低而且外源Loxi能稳定遗传的转基因小麦新种质。采用TaqMan实时定量PCR技术,以小麦内源控制籽粒硬度的主效单拷贝基因Pinb(puroindoline b)为内参基因,对6个转基因小麦TF5代株系外源Loxi拷贝数进行检测;同时以亚油酸为底物对这6个转基因株系种子脂氧合酶活性进行测定。结果显示,内参基因和外源基因扩增的标准曲线相关系数都接近于1,而且都具有合适的扩增效率,其中内参基因Pinb的扩增效率为107.7%;外源Loxi基因的扩增效率为104.5%;6个不同转基因株系中外源Loxi拷贝数不同,最小的为1,最大的为8;亲本品种陕优225和西农889种子脂氧合酶活性分别为(860±28.20)和(1 132±59.80)U;与其亲本材料相比,不同转基因株系种子脂氧合酶活性降低程度也不同(约为其亲本的21%~95%),有5个转基因株系与其亲本相比,酶活显著降低;其中亲本为西农889的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为2、6和8,与其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为32.76%、26.39%和21.05%;亲本为陕优225的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为1、3和6,其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为95.47%、51.06%和37.73%;外源Loxi拷贝数与种子LOX活性呈负相关。说明转基因株系中脂氧合酶基因的RNAi可有效抑制其种子LOX活性。本研究成功获得种子低脂氧合酶活性的转基因小麦材料,并对其外源Loxi拷贝数进行了准确测定;鉴定得到的种子脂氧合酶LOX活性显著降低的转基因小麦株系可为小麦育种提供新的亲本或种质材料。     

Lox基因RNAi转基因小麦后代株系种子耐储藏性分析

小麦(Triticum aestivum)种子中脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)可催化不饱和脂肪酸的氧化作用,在种子储藏期间产生氢过氧化物,导致小麦种子在储藏过程中种子活力和营养品质降低.因此,选育种子LOX活性低的小麦品种是小麦遗传改良的任务之一.为了获得种子脂氧合酶活性显著降低、外源Lox RNAi构件(Lox geneRNAiconstruct,Loxi)能稳定遗传且种子耐储藏性增强的转基因小麦新种质,本研究以小麦西农889、闫麦8911和陕优225转Loxi稳定遗传的TF7代转基因株系为材料,对转基因种子中Lox基因家族进行了半定量RT-PCR分析,结果表明,外源Loxi可有效抑制小麦籽粒中小麦脂氧合酶1(Triticum aestivum lipoxygenase Ⅰ,TaLox1)基因的表达,但小麦脂氧合酶2(Triticum aestivum lipoxygenase 2,TaLox2)和小麦脂氧合酶3(Triticum aestivum lipoxygenase 3,TaLox3)基因的表达量不变;对3个亲本及16个TF7代转基因株系的种子脂氧合酶活性检测,结果显示,与其亲本相比,转基因株系种子脂氧合酶活性显著降低;对人工加速老化处理7和14 d的转基因和对照种子分析发现,随着老化天数的增加种子活力降低,但转基因株系种子活力均显著高于其亲本材料;人工加速老化后脂肪酸组分和含量测定分析表明,转基因株系脂肪酸比其亲本材料氧化损失少.以上结果说明,转基因株系中Lox基因的RNAi可有效抑制其种子LOX活性,使转基因小麦后代种子耐储藏性增强;筛选鉴定得到的种子LOX活性显著降低且耐储藏性增强的转基因小麦株系可为小麦育种提供新的材料.     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。     

Ri质粒T-DNA对6年生转基因三倍体毛白杨生长和生理性状的影响

为探索外源基因在成年树木中的表达及稳定性,以转Ri质粒6年生三倍体毛白杨成年树木为材料,以同时种植的未转基因三倍体毛白杨为对照植株,对21个转基因株系和对照植株进行外源基因检测和生长、生理特性测定。PCR检测结果证明,Ri质粒T-DNA上的tms、rolC基因在各转基因株系基因组中稳定存在。转基因株系生长受到不同程度影响,各转基因株系的叶柄长、叶片长、叶片宽度和叶面积均小于对照植株,叶片长宽比大于对照植株;71%的转基因株系树高低于对照植株;81%的转基因株系胸径低于对照植株。转基因株系叶绿素a和叶绿素a+b含量、Fv/Fm值、PI值均低于对照植株。81%的转基因株系叶片内源GA3含量及所有株系叶片的内源IAA含量和IAA/ABA比值均高于对照植株,而86%转基因株系叶片的内源ABA含量低于对照植株。T-DNA能够在三倍体毛白杨成年树木中稳定表达,使植物体内内源IAA和GA3含量提高,生长受到抑制,但不同株系存在较大差异。本研究结果为进一步研究外源基因在植物体内的表达调控机制提供了参考依据。     

抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育

5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,epsps)是一个高抗草甘膦的基因,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因(Bt基因)cry1Ac M是一个能在单子叶植物中高效表达的抗亚洲玉米螟基因。为了获得具有抗虫、抗除草剂优良复合性状的转基因玉米,本研究构建出质粒p CAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1Ac M-Tnos,通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的玉米(Zea mays)茎尖遗传转化法将目标基因转入玉米。通过分子检测、草甘膦抗性筛选和田间接种亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis(Guenée))试验筛选出转基因株系,在此基础上进行了转基因植株室内抗亚洲玉米螟试验和田间草甘膦抗性分析,并采用RT-PCR检测和Western blot方法确定了抗虫蛋白在转基因植株中稳定表达。从大量转基因株系中优选出6个遗传稳定且抗亚洲玉米螟、抗除草剂草甘膦的转基因玉米株系,这些株系的抗亚洲玉米螟、抗草甘膦特性完全满足大田应用的需求。综上所述,将改造后的Bt抗虫基因cry1Ac M和抗草甘膦基因epsps一同转入玉米,赋予两种玉米骨干自交系植株抗玉米螟、抗草甘膦特性,为我国抗亚洲玉米螟抗草甘膦转基因玉米的大面积推广培育出了优良自交系。     

抗菌肽Shiva A基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传与表达分析

为进一步明确外源基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传稳定性及目标性状表现,本研究以转双价抗菌肽基因(ShivaA-cecropinB)纽荷尔脐橙(Citrus Sinensis Osbeck)无性繁殖后代植株为材料,通过PCR扩增,Southern杂交和实时定量PCR检测,以及温室抗病性评价分析等,对抗菌肽ShivaA基因在转基因柑橘后代株系中的遗传稳定性进行了研究.结果表明,外源抗菌肽Shiva A基因在转基因及其无性后代中能够稳定整合与表达.Southern杂交分析表明,ShivaA基因在无性繁殖后代基因组中为1个拷贝,而在T0代中为2个拷贝,由此推测T0代植株为混合嵌合体.定量PCR分析表明,ShivaA基因在To代中的表达水平低于其无性繁殖后代.本研究中外源基因的表达与拷贝数的多少成负相关.研究结果为开展转基因柑橘安全性评价提供了有用的实验材料,积累了有效的实验数据.     

Inheritance and Resistance to Insect in CryIA(c) Transgenic Cabbage

以结球甘蓝（Brassica oleracea var. capitata ）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）杀虫蛋白基因CryIA(c)导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA(c)和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA(c)基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40%，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。     

用两个抗虫基因分别转化水稻及抗虫株系的获得

用水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａＬ．）的幼胚、愈伤组织作受体,采用ＰＩＧ基因枪法,成功地将苏云金杆菌毒蛋白基因〖Ｂｔ毒蛋白基因,ｃｒｙＩＡ（ｂ）〗和马铃薯蛋白酶抑制剂基因（ｐｉｎⅡ基因）连同抗除草剂Ｂａｒ基因分别转入不同的水稻中,获得大量的转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交分析途中外源抗虫基因均分别整合到水稻的基因组中。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析显示它们在水稻叶片中表达的水平较高。外源基因在一代中遵循３     

转基因水稻中ThEn-42基因的稳定遗传及其抗病性的提高*

用农杆菌介导法将CaMV35S启动子调控下的外源基因ThEn-42转入粳稻(Oryza sativa ssp．japonica)品种台北309中。对100多株再生植株进行了PCR鉴定，结果表明，90％以上的植株为阳性植株。Southern检测的结果进一步证实，外源基因已经整合到水稻基因组中。对T1代植株也进行了PCR鉴定和潮霉素抗性鉴定，结果表明，大约70％的T1代转基因株系符合3：1(阳性：阴性)的分离比，表明ThEn-42基因在这些株系中有单个插入位点；大约20％的T1代株系分离比符合15：1，表明这些株系含有2个整合位点。选择部分T1代潮霉素抗性植株进行Southern杂交鉴定，结果证实，外源基因已经稳定遗传给T1代。检测了T0代和T1代转基因植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)和两个分别属于A群和B群的稻瘟病(Magnapotthe grisea)小种的抗性，结果表明，30%株系表现了对这两种病害抗性水平不同程度的提高。有7个株系的抗性与对照相比有显著的提高，其中Tp64表现对两个稻瘟病小种完全免疫。这些结果表明内切几丁质酶基因ThEn-42已经在受体植物中准确表达，并且在提高水稻抗病性方面起了重要作用。     

转三价抗虫基因棉花遗传特性研究

研究采用农杆菌介导法将外源三价抗虫基因(Bt CpTI GNA)导入常规棉花品种中获得转基因再生株,分子检测表明外源基因已在棉花体内表达并遗传给后代材料。其转化再生株后代材料经抗性检测,进行大田选育已至F8代。PCR分子检测与转化的标记基因和外源目的基因抗性三者极有规律性,转化后代材料分离有的符合孟德尔规律,有的则较偏离,其所携带的基因在转基因棉花低代材料中分离规律较为含糊,高代材料则较稳定。     

兔角蛋白基因转化棉花及其纤维品质的改良

利用农杆菌介导转化法,将棉纤维特异表达启动子GAE6-3A驱动的兔角蛋白基因（MP）转入常规棉花“冀合713”中。PCR及Southern杂交分析表明,兔角蛋白基因已整合进棉花基因组。6个转基因株系中,4个为单拷贝插入,转基因后代的分离符合孟德尔3：1的1对基因的分离规律,外源基因在这些转基因后代中能稳定遗传。对这4个转基因株系T3代纤维检测结果表明,兔角蛋白基因对棉花纤维品质的影响主要是纤维强度的提高,其中3个株系纤维强度提高率达10％以上。     

无载体框架结构的大豆铁蛋白线性表达盒提高小麦籽粒铁含量的研究

培育和推广铁强化型小麦品种对于经济有效地解决贫困人口的铁营养不良问题具有重要意义。本研究通过 RT-PCR 得到了大豆(Glycine max)铁蛋白基因,构建了无载体框架的大豆铁蛋白线性表达盒(即小麦籽粒特异的高分子量谷蛋白亚基 1Dx5 的启动子 - 大豆铁蛋白基因 -NOS 终止子酶切片段);用基因枪法转化"京花 1 号"小麦(Triticum aestivum)幼胚愈伤组织,经草胺膦筛选和分化后,得到 276 株转基因T0植株,通过 PCR 筛选出阳性植株 65 株;RT-PCR 检测发现 29 个株系的大豆铁蛋白基因在灌浆期籽粒中表达;与对照相比,对 8031 个 T1代株系所结的 T2代籽粒进行了铁含量测定,有 265 个株系成熟籽粒的铁含量均比对照有不同幅度提高,增幅在 4.93%~64.03%之间,其中 22 个株系的籽粒铁含量显著或极显著提高。结果提示,利用无载体框架的大豆铁蛋白线性表达盒可以有效地培育出籽粒铁含量显著提高的转基因小麦。     

转AtDREB1A基因菊花杂交后代优株水分胁迫耐性分析

过量表达拟南芥(A rab idopsis thaliana)逆境诱导转录因子DREB1A基因(AtDREB1A)能提高菊花的干旱胁迫耐性.以具有干旱胁迫耐性的转AtDREB1A基因菊花(Chrysanthemum morifolium)株系与广泛应用的非转基因菊花品种进行常规杂交获得的后代优株A-121、A-128、A-136为实验材料,进行了RT-PCR检测、水分胁迫下的萎蔫指数和成活率统计以及脯氨酸(Pro)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性测定.结果显示,外源A tDREB1A基因能够在有性繁殖过程中遗传给后代,且在水分胁迫下能在杂交后代植株中表达;与对照相比,水分胁迫条件下,转基因植株杂交后代Pro含量和SOD活性明显升高,且具有较强的水分胁迫耐性.研究结果表明,转基因菊花所携带的A tDREB1A基因可以在常规杂交中稳定遗传并发挥功能,提高了植株对水分胁迫的耐性.本研究为通过基因工程和传统育种结合方式选育具有干旱耐性的菊花新品种提供了技术平台.     

CryIA(c)转基因结球甘蓝的抗虫性研究

以结球甘蓝（Brassica oleracea var．capitata）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫蛋白基因CryIA（c）导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA（c）和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA（c）基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40％，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。     

不同发育时期转基因高梁不同株系Cry1Ab蛋白含量的比较

高粱的害虫种类众多，影响着产量与品质，培育抗虫品种是重要的育种目标，但目前高粱中缺乏有效的抗螟虫资源，难以通过常规育种培育出抗螟虫的品种。张明洲（2002）成功地将来自Bt密码子优化的抗虫基因crylAb转入高粱中，并经农业部批准进入中间试验阶段。为有效和合理地利用这一抗虫资源，有必要了解crylAb基因的表达情况，本实验分析了田间自然条件下crylAb基因在不同发育时期的表达水平，并对不同转基因高粱株系的CrylAb蛋白含量进行了比较。     

RPW2表达载体构建及对烟草的遗传转化

将RPW2基因插入表达载体pBI121的表达盒中,构建了RPW2组成型表达载体。通过农杆菌叶盘转化法转化烟草叶片,经卡那霉素筛选、PCR扩增和Southern杂交鉴定证明,RPW2基因已成功转入烟草细胞中,获得6个转基因株系。RT-PCR半定量分析表明,转基因烟草株系的叶片中有RPW2基因的表达。不同转基因株系表达量不同,转基因株系T-R2和T-R4表达量较高。转基因植株叶片上人工接种烟草赤星病菌液检测转基因植株的抗病性,结果表明,与对照植株相比转RPW2基因植株对烟草赤星病抗性显著增强,说明RPW2基因在烟草中也具有抗病能力。另外,转基因株系间RPW2基因表达量虽有差异,但抗病性没有显著差异。     

PHAs合酶phaC2基因转化烟草叶绿体的研究

中长链羟基脂肪酸聚酯 (medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。Ⅱ型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶。将编码Ⅱ型PHA合酶的基因phaC2与水稻(Oryza sativa )叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建表达盒(RpsbA-pro-phaC2-RpsbA-ter)，连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒(prrn-aadA-TpsbA-ter)一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD中，构建了烟草叶绿体转化表达载体pTC2。基因枪法转化烟草(Nicotiana tobacum L.)叶片，获得具有壮观霉素抗性的转基因烟草。对T0代和T1代转基因植株的PCR和Southern blot鉴定结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中，T1代转基因植株已达同质化。RT-PCR分析结果证实phaC2基因已在转录水平上表达。转基因植株的正反交试验证明外源基因在转基因后代中遵循母性遗传规律，不存在转基因的花粉漂移现象。通过叶绿体遗传转化, 实现中长链羟基脂肪酸聚酯合成关键酶基因phaC2在烟草叶绿体基因组中的稳定转化。     

Expression Pattern of Ａ Recombinant Phloem-specific Promoter from Pumpkin in Transgenic Potato Plants

以本实验室构建的重组南瓜(Cucurbita moschata)韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBdENP。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种Favorita，经过抗生素筛选，共获得转pBdENP和对照pBI121的抗卡那霉素马铃薯再生植株106株。通过PCR初步筛查，筛选出65株为转基因阳性植株。通过Southern blot对部分植株进一步分析,确证外源gus基因已经插入到转基因马铃薯植株的基因组中，插入拷贝数在1个或2个以上。对这些转基因马铃薯植株进行GUS染色结果表明, dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动gus基因的表达，前者仅在马铃薯的韧皮部内特异表达，而CaMV35S启动子驱动的gus基因为组成型性表达。GUS酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动gus基因表达水平没有明显区别。以上结果证明dENP启动子驱动的外源基因在马铃薯中也具有韧皮部特异而高效表达的特征，从而可用于马铃薯抗病、抗蚜虫转基因研究。