高渗胁迫对玉米大斑病菌生长发育及STK1表达的影响

【目的】观测高渗胁迫对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）生长发育的影响,探讨甘油是否为病菌细胞中的渗透调节物质,分析STK1在高渗胁迫下的表达规律。【方法】采用2种高渗胁迫条件处理玉米大斑病菌,分析高渗胁迫对病菌生长发育的影响;检测高渗胁迫下菌丝细胞中甘油含量的变化,明确甘油是否为病菌中的渗透调节物质;利用半定量RT-PCR方法,分析高渗胁迫条件下STK1表达规律。【结果】玉米大斑病菌菌丝细胞的等渗液浓度为0.78 mol•L-1;在高渗胁迫条件下,菌落颜色均发生显著变化。1 mol•L-1 NaCl处理后菌落呈红褐色,菌落的生长速率也受到到明显的抑制;在1 mol•L-1NaCl胁迫下菌丝细胞中原生质体浓缩,出现明显的浓缩颗粒;随胁迫时间的延长和渗透胁迫物质浓度的增加,细胞中甘油含量显著增加;STK1在高渗胁迫48 h内表达量稳定增加。【结论】高渗胁迫抑制玉米大斑病菌菌落生长,改变菌落颜色,使菌丝细胞中原生质体高度浓缩,部分菌丝膨大呈球状;甘油是病菌细胞中的一种渗透调节物质;STK1参与调控病菌的渗透胁迫反应。     

玉米大斑病菌Stgb-1基因正反义表达载体的构建与功能初探

玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)是严重威胁玉米生产安全的重要植物病原真菌。本研究在前期克隆得到的玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1的基础上,利用pSO-I质粒成功构建Stgb-1基因正反义表达载体,并将反义表达载体用于转化玉米大斑病菌的原生质体,获得了3个突变体菌株,分别命名为anti-GB-1、anti-GB-2和anti-GB-3。其中,anti-GB-2、anti-GB-3的菌落形态与野生型菌株差异较为明显,anti-GB-1则与野生型菌株没有表型差异。利用anti-GB-1对Stgb-1基因的功能进行分析,发现在反义表达诱导物奎宁酸溶液(15 mmol/L)中,野生型菌株的孢子萌发率为93.7%,而anti-GB-1的孢子萌发率仅为16%。推测Stgb-1基因调控了玉米大斑病菌的分生孢子萌发过程。     

玉米大斑病菌丝氨酸蛋白酶基因StSp8的克隆、原核表达及其表达模式分析

为了探究玉米大斑病菌丝氨酸蛋白酶基因StSp8的结构特征及其功能,本研究以玉米大斑病菌野生型菌株01-23的cDNA为模版,克隆该基因CDS序列并进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET30a-StSp8,在大肠杆菌BL21(DE3)中以IPTG诱导表达目的基因,通过SDS-PAGE技术检测目的蛋白的表达情况;利用qRT-PCR技术检测StSp8基因在不同发育时期和侵染时期的表达量变化。结果表明,丝氨酸蛋白酶StSp8的CDS序列由1602个核苷酸组成,编码533个氨基酸;其编码蛋白包含信号肽结构域、Inhibitor-I9结构域和Peptidase-S8结构域;SDS-PAGE结果显示该蛋白大小为57.18kD;表达模式分析发现,该基因在病菌发育的菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉5个典型的发育时期均有表达,其中芽管时期表达量显著升高;StSp8基因在侵染玉米24 h的表达量最高,72 h表达量下降。该研究不仅明确了StSp8基因的结构特征及在病菌生长发育及侵染寄主过程中的表达模式,也为深入揭示其功能奠定了基础。     

玉米大斑病菌STK2的基因组定位、蛋白质结构预测及其表达

【目的】确定玉米大斑病菌STK2在基因组中的位置;解析目的蛋白质Stk2的结构特征;构建STK2真核表达载体,获得真核表达体系中的胞外分泌蛋白。【方法】利用生物信息学方法,确定STK2在玉米大斑病菌基因组中的确切位置,解析Stk2蛋白质的结构特征;根据STK2的ORF序列及真核表达载体pPIC9K的多克隆位点设计引物,构建真核表达载体,采用电击转化法将重组质粒转入宿主菌 GS115 中进行诱导表达,利用SDS-PAGE检测并鉴定目的蛋白质。【结果】玉米大斑病菌STK2的ID为91433,该基因位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征性保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠较少且主要存在于N端,其三级结构具有1个较小的N端域和1个较大的C端域;成功构建了STK2的真核表达载体pPIC9K-STK2,筛选获得了抗性转化子;在毕赤酵母菌中,经甲醇诱导得到了1个分子量约为41 kD的蛋白质组分且被分泌至胞外,该蛋白质的大小与理论分子量相符,推测Stk2蛋白已在宿主菌中表达并被分泌至胞外。【结论】玉米大斑病菌STK2位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2具有MAPK激酶的所有特征性保守结构域,属于典型的MAPK蛋白激酶;该基因能在真核细胞中表达,获得了可溶性分泌蛋白质,为Stk2蛋白的多克隆抗体制备及基因的功能研究奠定基础。     

玉米大斑病菌St3HNR基因真核表达载体构建及表达分析

本研究在克隆获得玉米大斑病菌1,3,8-三羟基萘还原酶基因(St3HNR)的基础上,拟对该基因编码产物进行异源表达分析,明确基因功能.试验利用毕赤酵母真核表达系统,构建了玉米大斑病菌St3HNR基因的真核表达载体pPIC9K-St3HNR,采用电击转化法将重组质粒转入表达宿主菌GS115中得到了重组酵母菌株,经甲醇诱导...     

玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的克隆与基因表达分析

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用pET原核表达系统对Stga-2成功进行了异源表达。生物信息学分析表明,Stga-2全长1318bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码产物包含356个氨基酸残基。在347bp的上游侧翼序列中未发现典型的TATA-box及CAAT-box,但在起始密码子上游30bp处发现了转录起始子特征序列及位于其上游能够起始真菌基因转录的C+T丰富区域,同时还有转录因子Sp1的识别位点、CCA基序(CCAmotif)及CCG重复基序(CCG repeats)等顺式作用元件。【结论】玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的成功克隆与表达进一步丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。     

玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2结构分析及原核表达

【目的】对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因Stlac2进行生物信息学分析,推测其蛋白功能,探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Stlac2表达的影响,并对其进行克隆及原核表达,以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070(Stlac2)基因的全序列,通过Clustal X与马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)PbrB(PMAA_082060)基因、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Abr2(AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌(Aspergillus nidulans)YA(AN6635)基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对,查看Stlac2中的铜离子结合位点,利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测,通过SWISS-MODEL对Stlac2蛋白质的三维结构进行预测,采用SAVES对三维结构进行评价。通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响;利用RT-qPCR方法分析小分子物质对Stlac2表达规律的影响;采用原核表达系统,以pET-30a表达载体为框架,对其进行原核表达,并将表达蛋白纯化,以ABTS为底物,420 nm下检测漆酶活性。【结果】Stlac2具有典型的Cu离子结合位点,与漆酶典型的Cu离子结构域相似。其蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59%、25.63%、11.91%和43.86%,分子量为61.64 k D,等电点为5.00,平均疏水性为-0.37,表明其为亲水蛋白。当在PDA中添加0.01 g·L~(-1)香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时,玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸香兰素4-羟基苯甲醛4-羟基苯甲酸丁香醛对照。而在4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸存在时,玉米大斑病菌Stlac2的相对表达量明显升高,约为对照的5—8倍。利用原核表达系统,在67 k D处成功诱导表达出一条特异性蛋白条带,大量表达纯化后,漆酶活性为(40.7±0.3)U·L~(-1)。【结论】阐明了Stlac2的生物信息学特性,初步断定其为漆酶基因;4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸可显著提高Stlac2相对表达量,表明其在木质素降解过程中起到了一定的作用;该基因所编码的蛋白可通过pET-30a原核表达系统表达,体外漆酶活性可达(40.7±0.3)U·L~(-1),该研究结果为后期研究蛋白性质打下了基础。     

玉米大斑病菌HST生物合成基因簇的结构和表达分析

【目的】分析玉米大斑病菌寄主选择性毒素（host selective toxin,HST）生物合成基因簇Cluster 397.3的结构,以及该基因簇组成基因在玉米大斑病菌侵染过程中的表达情况,为玉米大斑病菌HST的结构和功能研究奠定基础。【方法】以玉米大斑病菌23号生理小种et28a和01-23菌株,1号生理小种ny001和01-11菌株,玉米感病自交系B37为材料,利用antiSMASH技术预测玉米大斑病菌次生代谢产物合成基因簇,通过Synteny共线性分析获得玉米大斑病菌HST生物合成基因簇Cluster 397.3,并对其基因组成和结构进行分析,再利用RNA-Seq技术分析该基因簇的组成基因在玉米大斑病菌侵染玉米叶片3,5,7,10 d的表达情况。【结果】玉米大斑病菌次生代谢产物合成基因簇Cluster 397.3与交链链格孢（Alternaria alternata）ACT-毒素合成基因簇有保守的共线性,含有1个聚酮合酶（PKS）、1个氨基甲酰磷酸合成酶（CPS）、1个短链脱氢酶/还原酶（SDR）、1个锌结合氧化还原酶（ZOR）、1个保守假定蛋白（CHP）、2个细胞色素P450（P450）及2个耐药转运蛋白（DRT）等9个基因。其中PKS与ACT-毒素合成酶基因ACTTS3同源,编码的聚酮合酶包括PksD、PS-DH、Methyltransf_12、PKS_KR、PKS_NbtC superfamily和NADB_Rossmann superfamily 6个典型结构域。RNA-Seq分析结果表明,将玉米大斑病菌接种玉米叶片3,5,7,10 d后,Cluster 397.3组成基因均能表达,且以3 d时表达量整体较高;除CHP基因外,01-11菌株中基因表达量均显著高于01-23菌株。【结论】Cluster 397.3基因表达差异与玉米大斑病菌生理小种的分化和致病特异性有关,该基因簇可能参与了玉米大斑病菌寄主选择性毒素的生物合成。     

玉米大斑病菌生理小种鉴定续报

70年代国内对玉米大斑病菌生理小种鉴定结果表明:全国只有1号小种。80年代初辽宁省丹东市农科所报道:在辽宁省丹东地区存在2号小种。80年代末,试验鉴定结果:吉林省(6个地区)、黑龙江省(哈尔滨)、河北省(保定)、山东省(烟台)出现2号小种,本文是1988年、1989年两年鉴定结果。     

STK1对玉米大斑病菌附着胞发育过程中糖原和脂肪积累的影响

【目的】通过研究STK1与附着胞发育的关系,明确附着胞发育过程中STK1对糖原和脂肪合成的调控作用,为阐明玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)附着胞发育的分子机制打下基础。【方法】以玻璃平板为疏水基质表面,通过"插片分离菌丝"法使菌丝附着于载玻平板表面,然后将附着有菌丝的玻璃平板置于保湿培养皿中22℃、14 h光照和10 h黑暗交替培养,诱导野生型菌株(WT)和STK1基因敲除突变体(ΔSTK1)的菌丝形成附着胞,每隔12 h显微观测附着胞的形态和发育过程;分别将附着有未经诱导的WT和ΔSTK1菌丝的玻璃平板和经过48 h附着胞诱导的玻璃平板浸没在I2/KI染色液中静置染色48 h,显微观察附着胞发育过程中糖原的变化;分别将附着有未经诱导的WT和ΔSTK1菌丝的玻璃平板和经过48 h附着胞诱导的玻璃平板置于-70℃的超低温冰箱中冷冻处理30 min,然后将玻璃平板置于Oil-red O染色液中静置染色24 h,显微观察附着胞发育过程中脂肪的代谢变化;利用real-time PCR技术检测附着胞发育过程中糖原和脂肪合成关键酶基因的表达情况。【结果】玉米大斑病菌WT菌株和ΔSTK1菌株利用菌丝尖端在玻璃平板的疏水表面均能够产生附着胞,但ΔSTK1菌株的附着胞发育与WT菌株显著不同,WT菌株48 h内为单胞附着胞,诱导48 h后少数附着胞形成了多细胞附着胞,而ΔSTK1菌株在诱导24 h后即出现了扭曲附着胞的异形附着胞形态,48 h后还出现了双杈、多杈和O型等多种异常的附着胞类型;WT菌株和ΔSTK1菌株的菌丝和附着胞进行糖原和脂肪的染色后,发现WT菌株的菌丝和附着胞都有均匀分布的糖原和脂肪,而ΔSTK1菌株的附着胞内几乎没有糖原和脂肪的积累,与WT菌丝的结果不同,在ΔSTK1菌株的菌丝内糖原沉积减少,脂肪主要分布于菌隔部位;附着胞诱导48 h后,WT菌株糖原合酶(glycogen synthase,GS)和二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol O-acyltransferase,DGAT)基因的表达量比诱导前分别增加了6.6%和40.3%,而⊿STK1菌株GS基因的表达量则下降了9.0%,DGAT基因的表达量仅上升了24.5%。【结论】STK1的功能缺失使玉米大斑病菌的附着胞发育形态异常,糖原积累下降,脂肪分布不均,糖原和脂肪合成的关键酶基因表达量均显著下降,表明糖原和脂肪代谢与玉米大斑病菌的附着胞发育密切相关。     

大鼠热休克因子结合蛋白1原核表达载体的构建及表达

以重组克隆载体pGEM—T—hsbp1为模板,PCR扩增hsbp1,用限制性内切酶双酶切、T4连接酶连接、转化BL -21的方法构建pGEX-2TK-hsbp1原核表达载体,实现了hsbp1在BL21中的表达,SDS—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,并利用亲和层析得到融合蛋白。     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。     

弓形虫AMA1蛋白的原核表达载体的构建及体外表达

[目的]构建截短型AMA1的原核表达载体,并进行体外诱导表达,为在体外表达弓形虫AMA1重组蛋白。[方法]设计去掉弓形虫AMA1信号肽的PCR引物,以弓形虫cDNA为模板进行PCR扩增,PCR扩增产物酶切后与pGEX-4T-3原核表达载体连接,并转化到BL21感受态细胞内。对经PCR鉴定为阳性的重组质粒pGEX-4T-3-AMA1进行体外诱导表达。[结果]成功构建了弓形虫AMA1的原核表达质粒pGEX-4T-3-AMA1,通过体外诱导表明,AMA1融合蛋白是以包涵体的形式存在。[结论]弓形虫AMA1蛋白的体外表达为进一步制备抗AMA1血清及免疫学实验奠定了基础。     

pGEX-4T-1-cMC4R原核表达载体的构建与表达

[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。     

小麦组蛋白H1基因保守序列原核载体的构建及表达

采用PCR技术扩增TAT-H1bs融合基因,并通过基因操作构建了融合基因的原核重组载体pET-28a-TAT-Hlbs。将阳性重组质粒转化至受体菌Rosseta(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western-blot检测。结果表明:重组菌能够表达目的蛋白,软件分析结果表明表达蛋白约占菌体蛋白的40%,上清表达量约为20%。上清蛋白经纯化后,Western-blot结果显示,His-Tag单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。所获得的融合蛋白以高效胞质可溶形式表达。     

苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

AFL1基因是苹果控制花发育的关键基因之一。在已得到AFL1 cDNA基因的基础上,将AFL1克隆到原核表达载体pET28b中,获得了重组表达质粒pET-AFL1,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳分析,结果显示,AFL1基因在大肠杆菌中成功表达,表达的AFL1融合蛋白分子量大约为53 kD。     

花生AhSOS2基因原核表达载体的构建及表达

SOS2(Salt Overly Sensitive 2)是植物中一类耐盐相关基因的统称,在植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本试验以花生AhSOS2基因全长cDNA为模板,经PCR扩增获得AhSOS2的蛋白编码区,将该区段与表达载体pET-28a(+)融合,构建获得原核表达载体pET-28a-AhSOS2,并进一步在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经1.0 mmol/L IPTG诱导后,获得一条约51 kD的融合蛋白条带,且随着IPTG诱导时间的延长,蛋白表达量逐渐提高,诱导8 h可获得较高的蛋白表达水平。