过氧化氢诱导蚕豆气孔保卫细胞一氧化氮的产生

过氧化氢(H2O2)和一氧化氮(NO)已被证明是植物中的信号分子,生物和非生物胁迫都可以导致H2O2和NO的产生.以蚕豆下表皮为材料,通过表皮条生物分析方法和激光扫描共聚显微镜显微技术,检测了H2O2诱导蚕豆气孔关闭过程中NO的产生.H2O2以浓度依赖的方式诱导气孔关闭,NO也有类似的作用.100 μmol/L H2O2诱导的气孔关闭作用可明显地被25 μmol/L一氧化氮合酶(L-NAME)专一性抑制剂或200 μmol/L一氧化氮清除剂(cPTIO)逆转.但L-NAME和cPTIO单独处理时对气孔开度几乎无影响.表皮条经100 μmol/L H2O2处理,再用NO分子探针乙酰乙酸盐-4,5-二氨基荧光黄(DAF-2 DA)孵育后,与对照相比,保卫细胞胞质中荧光强度明显增加.结果表明NO可能参与H2O2诱导的气孔关闭,保卫细胞中H2O2可能是通过NOS途径诱导NO的产生,而且H2O2可能作为上游信号分子诱导NO的产生.     

硒通过调控小白菜幼苗根内NO与H_2S信号诱导BrRbohG1/BrRbohG2表达

为了研究硒对农作物胁迫的机理,本试验以小白菜(Brassica rapa chinensis)幼苗为材料,研究了亚硒酸钠(Na2Se O3)处理下,根中内源信号分子一氧化氮(NO)和硫化氢(H2S)的变化与BrRboh G1和BrRboh G2表达的关系。结果表明:0.03~0.46 mmol/L的Na2Se O3显著抑制根的生长,并呈现浓度效应;随着Na2Se O3处理浓度的升高,内源NO含量逐渐上升,而内源H2S逐渐下降,两者呈显著负相关;添加NO合成抑制剂(L-NMMA和Tungstate)或NO清除剂(c PTIO)能够显著抑制Na2Se O3对内源H2S的诱导作用;Na2Se O3处理能够显著诱导根内BrRboh G1和BrRboh G2的表达,分别添加L-NMMA、Tungstate、c PTIO、H2S供体Na HS均能显著抑制Na2Se O3对上述两基因表达的诱导作用。说明Na2Se O3处理下,内源NO介导了Na2Se O3对BrRboh G1和BrRboh G2的诱导表达,而H2S则可能抑制了两个基因的表达;NO也可能作用于H2S信号的上游。     

两种黄单胞病菌诱导水稻一氧化氮产生和防卫基因表达的比较研究

 【目的】阐明在不同黄单胞病菌诱导的水稻过敏性细胞死亡(HCD)中的一氧化氮(NO)信号途径及其作用机制。【方法】比较分析了在水稻细胞－番茄斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)不亲和互作、水稻－白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae, Xoo)亲和互作中NO的发生以及NO对水稻防卫基因诱导表达的影响。【结果】Xcv不仅诱导了NO的迸发、NOS活性及其NO合成相关基因(nos和nr)的表达，而且诱导了防卫基因(苯丙氨酸解氨酶基因pal、过氧化物酶基因pox和谷胱苷肽转硫酶基因gst)的表达；Xoo不诱导NO的迸发，抑制了NOS的活性、NO合成相关基因和防卫基因的表达；NO清除剂PTIO和Xoo显著地抑制了Xcv 对防卫基因表达的诱导作用。【结论】Xcv通过NO信号途径诱导了水稻防卫基因的表达和HCD；Xoo 通过NO抑制或解毒机制抑制了由NO介导的防卫基因的表达及其HCD的发生。     

盐酸法舒地尔对C3H10T1/2细胞增殖与 成脂分化的影响

【目的】探讨Rho分子信号通路阻断剂盐酸法舒地尔(HA1077)对C3H10T1/2细胞体外增殖及成脂分化的影响。【方法】体外培养C3H10T1/2细胞株,用HA1077浓度梯度培养液(0(对照组),20,40,60,80,100μmol/L)对其进行处理,通过MTT比色法和油红O染色法分别检测C3H10T1/2细胞的增殖和分化情况。【结果】HA1077对C3H10T1/2细胞的体外增殖有一定的抑制作用,且呈现出一定的浓度依赖性。但HA1077可提高C3H10T1/2细胞的成脂分化效率,也呈浓度依赖性;且当HA1077浓度大于60μmol/L后,细胞成脂分化率与对照组差异极显著(P<0.01)。【结论】HA1077可抑制C3H10T1/2细胞的增殖,但同时可以促进其成脂分化。     

土荆芥挥发油诱导玉米保卫细胞Caspase依赖性凋亡及信号调节

【目的】探讨入侵植物土荆芥(Chenopodium ambrosioides L.)挥发油对粮食作物玉米(Zea mays L.)保卫细胞的化感效应及其作用机制。【方法】以玉米叶片下表皮保卫细胞为对象,研究了土荆芥挥发油的毒性作用。【结果】经挥发油处理后保卫细胞核形态变化,细胞活性显著降低,细胞核畸变率和死亡率随处理剂量或时间的增加而显著升高(P0.05)。保卫细胞经TUNEL检测呈阳性,与土荆芥挥发油单独作用相比,挥发油和泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同作用后细胞活性显著升高,表明土荆芥挥发油诱导玉米保卫细胞出现了Caspase依赖性的细胞凋亡;Ca~(2+)通道抑制剂LaCl_3、Ca~(2+)螯合剂EGTA、硝酸还原酶抑制剂NaN_3、NO合成酶抑制剂L-NAME、活性氧清除剂AsA或过氧化氢酶CAT等可缓解土荆芥挥发油的细胞毒性。【结论】土荆芥挥发油对玉米保卫细胞有显著的细胞毒性,诱导保卫细胞发生Caspase依赖性的细胞凋亡,NO、ROS和Ca~(2+)等信号分子参与了土荆芥挥发油诱导玉米保卫细胞凋亡的信号调节过程。     

乳清蛋白抗氧化肽对H_2O_2所致人胚肺成纤维细胞MRC-5过氧化损伤的保护作用

【目的】探讨纯化后的乳清蛋白抗氧化肽P4对人胚肺成纤维细胞(human lung fibroblast)MRC-5过氧化损伤的保护作用及可能的作用机制。【方法】采用H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型,应用四唑蓝快速比色法(MTT法)检测细胞存活率,通过检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量,来确定P4对过氧化损伤MRC-5细胞的保护作用,并利用电镜观察细胞形态学变化。【结果】1mmol·L-1H2O2孵育24h可显著诱导MRC-5细胞损伤,使细胞存活力下降到22.47%,细胞经不同浓度的抗氧化肽P4(4、20、100μg·mL-1)与H2O2共孵育后,特别是100μg·mL-1(高剂量组)抗氧化肽P4可使细胞存活率达到44.77%。同时,提高乳清蛋白抗氧化肽P4的浓度,可促进受损的MRC-5细胞修复,提高了SOD、CAT、GSH-Px酶活性,降低MDA含量。扫描电镜和透射电镜观察结果也表明,一定浓度的乳清抗氧化肽对MRC-5细胞具有保护作用。【结论】乳清抗氧化肽通过拮抗H2O2而对MRC-5的过氧化损伤具有保护作用。     

质膜ATP酶介导机械伤害诱导豌豆叶片的防御反应

【目的】研究质膜ATP酶(H+-ATPase)在机械胁迫诱导植物防御反应形成中的作用。【方法】通过酶活性生化测定、Western blot检测和电镜细胞化学观测方法,研究机械伤害对豌豆幼苗质膜H+-ATPase活性的影响;同时结合药理学实验,进一步探讨了质膜H+-ATPase与活性氧积累在伤害防御反应中的关系。【结果】机械胁迫能诱导质膜H+-ATPase活性提高,但并未改变该酶蛋白含量;抑制质膜H+-ATPase活性,伤诱导的H2O2累积和苯丙氨酸解氨酶活性提高随之被抑制,活性氧清除剂处理对伤诱导质膜H+-ATPase活性提高没有影响。【结论】质膜H+-ATPase参与机械胁迫诱导防御反应相关的信号传递,该酶可能作用于活性氧信号上游,并通过蛋白磷酸化调节来诱导下游防御反应形成。     

β-氨基丁酸诱导马铃薯对晚疫病的抗性组织化学及信号传导途径分析

【目的】β-氨基丁酸（BABA）田间或离体叶片喷洒能够有效诱导马铃薯防卫反应,增强对晚疫病的抗性。研究从组织化学层面进一步探究BABA诱导马铃薯晚疫病抗性过程中诱发的防卫反应及相关信号途径,为深入研究BABA诱导马铃薯产生晚疫病抗性的可能机制奠定基础。【方法】用4 mmol?L-1 BABA或蒸馏水（对照,Mock）喷洒马铃薯植株叶片,3 d后取离体叶片接种晚疫病菌（Phytophthora infestans）,接种后不同时间用打孔器取接种点叶盘用于织化学染色和过敏反应（HR）观察。采用二氨基联苯胺（DAB）组织化学染色方法检测接种点周围活性氧（H2O2）累积情况;叶盘用苯胺蓝（aniline blue）染色,然后在荧光显微镜下观察接种点周围胼胝质积累和表皮细胞HR发生情况;利用干涉了StCOI1（阻断了茉莉酸JA信号传导途径）和超量表达细菌水杨酸羟化酶基因NahG（阻断了水杨酸SA信号传导途径）的转基因马铃薯株系为材料,通过研究BABA能否在这些特殊马铃薯材料上有效诱导晚疫病抗性,进而推断BABA诱导马铃薯晚疫病抗性可能参与的信号途径。【结果】用清水作为空白接种时,Mock和BABA预处理叶片各时间点均未观察到H2O2积累,而病原菌接种处理24 h后,Mock和BABA预处理叶片接种点周围都出现H2O2积累,随着病原诱导时间的延长,H2O2积累增强。但是,BABA预处理叶盘中接种点周围H2O2累积比对照提前12 h,且累积量显著强于对照。苯胺蓝染显示Mock和BABA预处理叶片在接种清水时检测不到胼胝质的沉积,而接种晚疫病菌24 h后,Mock和BABA预处理叶片上均观察到胼胝质的沉积,BABA预处理叶片在侵染点及其附近胼胝质积累量要显著高于对照。荧光显微观察结果显示,BABA预处理和Mock叶片晚疫病接种点周围表皮细胞均有HR发生,BABA预处理叶片早在接种24 h后,接种点周围就已出现HR反应;接种48 h时,BABA预处理85%叶盘的接种点周围表皮细胞出现HR,而Mock叶片只有30%叶盘上观察到HR,BABA预处理叶片HR发生频率比Mock叶片高出55%。BABA不能在超量表达NahG的马铃薯叶片上有效诱发抗性,但能够在干涉了StCOI1的马铃薯叶片上正常诱导产生抗性。【结论】BABA能够从H2O2和胼胝质累积以及HR发生多个层面有效诱发马铃薯基础防御反应,BABA预处理能够在病原菌侵染点周围显著提高胼胝质和H2O2积累水平,诱发接种点发生较高频率的HR,从而提高马铃薯对晚疫病的抗性;BABA诱导马铃薯对晚疫病的抗性依赖水杨酸信号传导途径,但不依赖茉莉酸信号传导途径。     

表面活性剂对H_2O_2诱导葡萄叶白藜芦醇含量升高的增效作用

【目的】H2O2水溶液可以诱导葡萄叶片中白藜芦醇含量升高,前期研究发现喷洒法诱导效果有限,与叶表面与诱导剂接触不充分有关。研究使用H2O2与表面活性剂SDS、TX-100混合以喷洒的方式诱导葡萄离体叶片,以期改善并提升诱导效果。【方法】以红地球葡萄叶片为试验材料,以表面活性剂SDS、TX-100与H2O2溶液为供试材料。采用H2O2处理离体葡萄叶片,宏观荧光法定性检测白藜芦醇,HPLC法检测白藜芦醇含量的变化,DAB染色法检测氧化胁迫程度。【结果】H2O2溶液处理离体葡萄叶片,可使离体叶片中H2O2含量升高并造成氧化损伤,同时使叶片中白藜芦醇含量升高。表面活性剂SDS、TX-100显著增加了H2O2的诱导作用,也带来了氧化损伤程度加重。以TX-100诱导组含量最高,达到(85.88±0.34)μg/g。【结论】表面活性剂TX-100、SDS对H2O2诱导葡萄叶中白藜芦醇含量有增效作用。     

磷脂酰肌醇3-磷酸对UV-B诱导蚕豆保卫细胞中过氧化氢产生和气孔关闭的影响

【目的】研究磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）催化产物磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）对紫外线B（UV-B）诱导保卫细胞中过氧化氢（H2O2）产生和气孔关闭的影响,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以蚕豆（Vicia faba L.）表皮条为材料,采用PI3K的抑制剂沃曼青霉素（WM）和LY294002（LY）来抑制PI3P的形成,采用二苯基碘（DPI）和水杨基氧肟酸（SHAM）分别抑制H2O2形成的NADPH氧化酶途径和细胞壁过氧化物酶途径,通过气孔开度分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,确定PI3P在0.8 W•m-2 UV-B辐射诱导蚕豆保卫细胞H2O2产生和气孔关闭中的作用。【结果】WM和LY能显著抑制UV-B诱导的保卫细胞H2O2产生和气孔关闭;外源H2O2处理能显著逆转WM和LY对UV-B诱导气孔关闭的抑制效应,但WM和LY不能抑制外源H2O2诱导的气孔关闭;UV-B诱导的保卫细胞H2O2产生和气孔关闭能被活性氧清除剂和SHAM显著抑制,但不能被DPI抑制。【结论】PI3P通过诱导蚕豆保卫细胞中产生于过氧化物酶途径的H2O2形成来介导UV-B辐射诱导的气孔关闭。     

水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种非寄主互作体系中病原细菌过氧化氢的作用

 【目的】探讨互作体系中病原菌来源过氧化氢的作用。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种互作体系中的过氧化氢积累的定位。【结果】突变体菌株细胞中烷基过氧化物还原酶亚基C的缺失导致胞内其余过氧化氢清除酶活性的补偿性显著上升,使胞内内源过氧化氢积累水平显著下降,并引起病原菌与水稻互作体系中的过氧化氢积累水平发生显著变化。【结论】病原细菌很可能是互作体系中过氧化氢的一个重要来源。病原细菌产生的过氧化氢很可能在非寄主互作中造成细菌周围植物细胞的损伤,对植物细胞具有潜在的毒性。     

小白菜幼苗对二氧化氮胁迫的应答及过氧化氢的调节

 【目的】研究小白菜幼苗对二氧化氮（NO2）急性胁迫的应答及过氧化氢（H2O2）的调节作用。【方法】在自制的熏气箱中对供试植株进行NO2（浓度分别为0.25、0.5、1.0和2.0 μl•L-1）熏蒸24 h （10﹕00～次日10﹕00），测定某些生理生化指标。延长熏气至7 d，每天7 h （8﹕00～15﹕00），测定植株的生长速率。为了评价外源H2O2在植株对NO2应答中可能的调节作用，熏气前1 d对试验组叶面喷洒10 mmol•L-1 H2O2溶液（相当于每棵植株喷洒约1 mg H2O2），对照组喷洒等量蒸馏水。【结果】0.25 μl•L-1 NO2促进小白菜生长，而0.5 μl•L-1及以上浓度NO2使植株生长速率和叶绿素含量显著降低，叶片硝酸还原酶（NR）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量增加；1 μl•L-1及以上浓度NO2使老叶片出现坏死，绿色部分的过氧化氢酶（CAT）活性和硝酸盐（NO3-）含量增加，抗坏血酸（ASA）含量和光合速率下降，但气孔导度不受影响。10 mmol•L-1 H2O2预处理显著减轻NO2对植株的不利影响，其中生长速率、ASA和MDA含量等与只通入碳滤空气的对照水平相当，光合速率明显恢复，但NO3-含量和NR活性没有变化，SOD和CAT活性被进一步诱导，气孔导度降低。【结论】NO2急性胁迫引发了小白菜幼苗氧化胁迫伤害；H2O2预处理提高了小白菜的抗氧化能力，增强了对高浓度NO2的耐受性；NO2熏蒸使小白菜叶片NO3-含量增加。     

IWF诱导小麦悬浮细胞H2O2迸发及其产生机制初探#br#

【目的】采用具有激发子活性的感染叶锈菌的小麦叶片细胞间隙液IWF-260刺激小麦洛夫林10悬浮细胞,探讨细胞感受激发子刺激引发的H2O2迸发情况及其产生的可能分子机制。【方法】采用化学发光法以及荧光探针DCFHDA、HE来研究H2O2的迸发以及NADPH氧化酶的活化。同时借助药物学试验探讨Ca2+和活性氧的关系。【结果】IWF-260可以引起悬浮细胞H2O2爆发,其在IWF-260刺激诱发的细胞死亡过程中发挥重要作用。而质膜NADPH氧化酶的激活以及胞外钙离子的内流与H2O2爆发有密切关系。【结论】IWF-260能够诱导细胞产生活性氧,质膜NADPH氧化酶和胞外钙离子内流参与了活性氧爆发过程。     

IWF诱导小麦悬浮细胞产生NO及其与Ca2+的关系

 【目的】以感染叶锈菌的小麦叶片细胞间隙液IWF-260作为激发子,刺激小麦洛夫林10悬浮细胞,探讨悬浮细胞受激发子刺激引发的NO变化情况及其产生的可能分子机制。【方法】采用Greiss试剂法及荧光分子探针DAF-2DA标记法检测胞内NO的动态变化,同时借助药物学试验探讨Ca2+和NO的关系。【结果】IWF-260能诱导小麦悬浮细胞产生NO,NO在IWF-260刺激诱发的细胞死亡过程中发挥重要作用。药物学抑制剂试验证明NOS和NR及胞外钙离子内流均与IWF-260刺激小麦悬浮细胞产生的NO有密切关系,且在NO的产生途径中,NR途径为主要途径。【结论】IWF-260能够诱导小麦悬浮细胞产生NO,NOS、NR及胞外Ca2+内流参与了此过程。     

藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选

【目的】通过对抗逆植物藜的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径中MAPKK的胁迫表达模式分析及信号转导途径互作组分的筛选,探索植物藜响应外界胁迫信号诱发逆境耐受的机制。【方法】以藜叶片总RNA为模板,利用定量PCR方法对NaCl、H2O2和ABA胁迫下藜MAPKK表达规律进行了分析。利用RT-PCR结合RACE技术获得了藜MAPKK的全长cDNA序列。利用酵母双杂交技术对MAPKK盐胁迫信号通路互作组分进行了分析。【结果】获得一个藜MAPKK的全长cDNA序列,命名为CaMAPKK2,其开放阅读框为1 089 bp,编码一个由362个氨基酸组成的丝裂原活化蛋白激酶。定量PCR显示CaMAPKK2受盐胁迫诱导明显上调表达,同时受外源H2O2和ABA调控。H2O2合成抑制剂DPI与ABA合成抑制剂Na2WO4显著抑制了300 mmol•L-1 NaCl处理下CaMAPKK2的表达。以全长CaMAPKK2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选到5个可能与CaMAPKK2相互作用的蛋白。测序结果显示,其中1个序列可通读,该cDNA序列长794 bp,与欧洲赤杨（Alnus glutinosa）和拟南芥的噻唑合成酶（thiazole biosynthetic enzyme）基因AgTHI1和AtTHI1核酸序列相似度达79%和78%,其它4个序列没有连续的读码框。【结论】CaMAPKK2受NaCl和H2O2诱导上调表达,暗示盐胁迫可能通过诱导H2O2和ABA的积累从而导致CaMAPKK2表达增加。要进一步筛选CaMAPKK2互作组分需获得更多阳性克隆并开展相关功能验证试验。     

微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用

 【目的】阐明微丝骨架在小麦非寄主抗病性中的作用。【方法】以小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作体系为研究对象,通过台盼蓝、DAB和考马斯亮蓝染色法研究了小麦叶片经微丝骨架解聚剂处理后过敏性坏死、H2O2及乳突形成的变化。【结果】黄瓜白粉菌在小麦叶面上萌发明显滞后且附着胞多畸形。药剂处理后,过敏性坏死反应和H2O2的产生及乳突的形成均明显受抑,产生率均显著降低。白粉菌的侵入率明显提高,并且能形成吸器,偶尔还产生次生菌丝。【结论】微丝骨架参与了小麦的非寄主抗病性反应,骨架的聚合为抗病性反应的发生所必须。     

罗汉果皂甙清除自由基及抗脂质过氧化作用的研究

 【目的】研究罗汉果皂甙提取物及罗汉果皂甙V的体外抗氧化活性。【方法】采用D-脱氧核糖法、抗超氧阴离子试剂盒法及比色法分析罗汉果皂甙清除自由基及抗脂质过氧化的效果。【结果】 （1）罗汉果皂甙提取物（MG）均能有效地清除自由基，可抑制大鼠肝组织的脂质过氧化，对Fe2+和H2O2诱导的肝组织过氧化损伤具有保护作用，能减少红细胞溶血的发生。（2）罗汉果皂甙V清除羟基自由基的效果与MG相当，但对O2--的清除作用优于MG。【结论】罗汉果皂甙提取物具有抗氧化活性，罗汉果皂甙V是提取物中主要的抗氧化活性成分。     

汞盐诱导烟草悬浮细胞产生细胞编程死亡

【目的】阐明氯化汞处理烟草悬浮细胞产生的细胞死亡具有细胞编程死亡（programmed cell death,PCD）的特征和分子机制。【方法】采用形态和生物化学方法观察氯化汞处理细胞后的变化,并采用药理学方法,通过添加抑制剂和抗氧化剂阐明氯化汞引发的信号转导途径。【结果】氯化汞诱导产生的细胞死亡具有PCD特征,包括染色质浓缩、细胞核的TUNEL检测呈阳性和DNA ladder的形成。氯化汞诱导烟草悬浮细胞过氧化氢积累,过氧化氢酶和抗坏血酸等抗氧化剂能降低细胞死亡率。蛋白激酶抑制剂、磷脂酶C和磷脂酶D的抑制剂能显著地降低氯化汞引起的细胞死亡和过氧化氢积累。【结论】氯化汞引起的细胞死亡是一种PCD,蛋白激酶和磷脂信号介导的过氧化氢积累参与细胞死亡过程。