香蕉果实expansin cDNA克隆及序列分析

提取成熟香蕉果肉的RNA并分离mRNA，以mRNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，设计expansin的简并引物，进行RT-PCR(退火温度为50℃)，得到的扩增产物纯化后与pGEM-T-Easy载体连接，转化大肠杆菌，任意挑选2个阳性克隆，进行序列分析，结果得到2个序列相同的expansin的cDNA基因片段，命名为MA-Exp3(以示与已登录的香蕉MA-Expl和MA-Exp2的区别)，MA-Exp3中存在expansin基因的保守区域，即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基，它编码177个氨基酸，与MA-Exp1的核苷酸同源性为74．2％，氨基酸同源性为86．4％。     

玉米抗病相关侯选基因DNA片段克隆

根据已克隆的植物抗病基因的保守序列设计引物,对玉米ＤＮＡ进行扩增、克隆并对部分克隆进行了测序。测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ进行序列同源性比较分析。其中ｐＧＥＭ２－２３号克隆与玉米中乙醇脱氢酶基因（ａｄｈ１）在１５０４７～１５２７２ｂｐ处具有８５％同源性;ｐＧＥＭ２－２５号克隆与水稻ＢＡＣ库中１０号染色体的ＯＳＪＮＢａ００５５Ｐ２４克隆片段在６７００５－６７１５１ｂｐ处具有８２％同源性。推测ｐＧＥＭ２－２３克隆为－与乙醇脱氢酶有类似作用的抗病相关侯选基因的片断。     

柔嫩艾美耳球虫广东株微线蛋白-2 基因的克隆与序列分析

根据柔墩艾美耳球虫(Eimeria lenella)微线蛋白—2基因的cDNA序列设计一对特异性引物，以F．tenella广东株(EtGD)子孢子总RNA为模板，用RT—PCR方法成功扩增出EtGD微线蛋白—2(EtMic—2，GD)的cDNA序列。PCR产物连接到质粒pGEM—T—easy后，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒经测序并与E．tenella北京株和豪顿株的MIC—2比较，开放阅读框架(0RF)核苷酸序列的同源性分别为99．70％(1023／1026)和99．61％(1022／1026)，推导的氨基酸序列间分别有两个氨基酸不同，同源性为99．41％(340／342)，经DNAsisstl．02分析，这种差异可影响EtMic—2的抗原性。     

牛源犬新孢子虫IMP1基因的克隆与序列分析

[目的]为了解牛源犬新孢子虫IMP1基因生物学特性,分析牛源犬新孢子虫IMP1基因的克隆与序列。[方法]应用PCR技术扩增IMP1基因,将纯化的PCR产物和pMD18-T Simple Vector连接,构建pMD18-IMP1重组克隆质粒,进行PCR鉴定和酶切鉴定,将鉴定为阳性的质粒进行测序分析。[结果]PCR扩增犬新孢子虫IMP1基因大小为762 bp,克隆质粒经测序分析与GenBank（XM003879531.1）中IMP1基因的同源性为99.9%。[结论]该试验为犬新孢子虫IMP1基因的表达及后续研究奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒河南分离株（HN04）A片段cDNA的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,以传染性法氏囊病毒河南分离株(HN04)基因组RNA为模板,扩增并克隆IBDV HN04株基因组A片段cDNA。测序结果表明:克隆的A片段全长3260个核苷酸,包括2个部分重叠的开放阅读框(ORFl和ORF2)及两端的非编码区。ORFl和ORF2分别编码含有1012个氨基酸的结构蛋白(VP2-4-3)及含有145个氨基酸的VP5。IBDV HN04株基因组A片段核苷酸序列与来自GenBank IBDV血清Ⅰ型毒株核苷酸序列的同源性高达94.9%～99.4%,血清Ⅱ型毒株核苷酸序列同源性为83.8%。对IBDV HN04株的A片段核苷酸及其推导氨基酸进行序列分析,结果显示HN04株与国内外IBDV数株弱毒株的同源性在99.0%以上。     

家蚕SOCS-2基因的克隆与序列分析

SOCS基因是JAK/STAT信号通路的负调节基因.为了了解家蚕SOCS基因(BmSOCS)的遗传变异与进化,通过电子克隆获得了SOCS cDNA基因序列,结果显示家蚕基因组中至少存在4种BmSOCS基因,BmSOCS -2基因存在可变剪接.通过RT - PCR从家蚕中扩增得到1个BmSOCS -2基因(BmSOCS - 2A),测序结果表明,该792 bp片段含有完整的ORF,由4个外显子组成,编码263个氨基酸残基,分子量为28.8 ku.结构分析显示,BmSOCS - 2A有5个α螺旋结构,存在典型的SH2结构域和SOCS结构域.基因芯片数据分析显示,BmSOCS -2在家蚕雌雄性腺组织中表达量最高.进化分析表明,SOCS以不同种类聚类在一起,表明各种SOCS基因家族在各昆虫物种形成前就已产生.     

根结线虫rDNA-ITS片段的克隆与序列分析

用PCR方法扩增了16个不同地区和不同作物上根结线虫群体的ITS片段,并进行了克隆、序列测定分析和比对。结果表明:采自北京密云苦瓜和豇豆、北京通州月季以及山东胶州、烟台、潍坊花生上的6个根结线虫群体为北方根结线虫(Meloidogyne hapla),其ITS片段大小为772 bp;来自云南番茄、成都黄瓜和海南石榴上的3个根结线虫群体为爪哇根结线虫(M.javanica),其ITS片段大小为767 bp;来自河北廊坊番茄、北京海淀番茄和浙江黄瓜上的3个根结线虫则属于花生根结线虫(M.arenaria),其ITS片段大小为768 bp;而安徽和县、宿州的番茄以及太和桔梗上的3个根结线虫则属于南方根结线虫(M.incognita),其ITS片段大小为766 bp;海南胡椒上的根结线虫群体为番禺根结线虫(M.panyuensis),ITS片段大小为869 bp。     

黑曲霉木聚糖酶和β-葡聚糖酶cDNA片段克隆和序列分析

木聚糖酶（1,4-β-xylanase, EC 3.2.1.8)以内切方式水解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键，其水解产物主要为木二糖及木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。该酶不仅对于降解自然界大量存在的半纤维素起着重要作用，而且也具有潜在的应用前景，如在造纸工业中用它作为纸浆的漂白剂,饲料工业中可提高纤维类饲料的消化利用率。β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)能分解大麦中以β-1,3和β-1,4混合键连接的结构性非淀粉多糖β-D-葡聚糖，属于半纤维素物质。在啤酒工业中应用β-1,3-1,4-葡聚糖酶，可提高麦汁分离速度，减少啤酒混浊度和胶状沉淀物，从而改善啤酒质量；在大麦日粮中，可改善谷物营养价值，提高畜禽生长速度和饲料转化率。因而木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为重要经济价值酶，对于生物资源的开发利用具有重要作用。研究结果表明，微生物的木聚糖酶存在着多态性，有关黑曲霉木聚糖酶基因在国内尚未见报道。β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其基因方面的报道主要为芽孢杆菌，在真菌中仅报道厌氧菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因。我们克隆了黑曲霉FS6的木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的cDNA片段并分析了序列。……     

家蚕糖转运蛋白BmST1基因的克隆与序列分析

糖转运蛋白运输葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等透过细胞膜为机体提供能量.根据GenBank已登陆的其他物种的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST1.基因编码区长1 392 bp(GenBank登录号:FJ373021),编码463个氨基酸,预测蛋白分子质量为51.635 kDa.序列分析显示基因有2个外显子,含有11个跨膜结构域.RT-PCR表明该基因仅在此文所检测的家蚕丝腺中表达.     

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA片段的克隆和序列分析

利用简并引物，采用PCR等分子生物学技术，对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)α亚基的cDNA片段进行克隆，并对序列进行分析。测序结果显示，扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的3种亚型（分别命名为Pxαl，Pxα2，Pxα3）。都具有典型的α亚基的结构；2个相邻的半胱氨酸，由2个半胱氨酸之间二硫键形成包含15个氨基酸的胞外环，与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基，克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达65%-99%的同源性，表明克隆的cDNA片段是小菜蛾nAChRα亚基基因的部分序列。     

沙田柚黄龙病病原β-操纵子DNA片段的克隆与序列分析

采集表现斑驳症状的沙田柚叶片,根据柑桔黄龙病特异保守区域β-操纵子序列设计引物,通过对其病叶脉总DNA进行PCR扩增、扩增产物纯化、与pMD18-T Vector连接、转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5a菌株、筛选阳性克隆重组子、重组子测序,并将测序结果与柑桔黄龙病病原β-操纵子部分DNA相应序列进行比较.结果表明,引起沙田柚斑驳症状的病原与亚洲柑桔黄龙病原(Liberobacter asiaticum)相应序列的同源率为99%,而与非洲柑桔黄龙病病原的同源率仅为79.9%.因此,从分子水平上证明沙田柚斑驳症状是由黄龙病病原侵染所致,该病原属于亚洲种中的一个成员.     

家蚕质型多角体病毒苏州株基因组片段2的克隆与分析

为了探讨呼肠孤病毒科依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP)基因的遗传与变异,通过RT-PCR对家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)苏州株(BmCPV-suzhou)的S2片段进行了分段克隆,对各克隆的测序结果进行拼接,获得了S2片段的全长序列.分析显示,BmCPV-suzhou S2片段的全长为3 854 bp(GenBank登录号:CQ924586),含有1个3 678 bp的编码RDRP基因的开放阅读框,并分别在5′和3′端发现了保守序列AGUAA和GUUAGCC.RDRP的氨基酸序列比对分析结果显示,BmCPV-suzhou与BmCPV-china、BmCPV-1、舞毒蛾(Lymantria dispar)CPV-1(LdCPV-1)、马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)CPV-1(DpCPV-1)、舞毒蛾CPV-14(LdCPV-14)、棉铃虫(Heliothis armigera)CPV-14(HaCPV-14)的相似性分别为99%、97%、94%、94%、54%、55%.基于RDRP氨基酸序列的系统进化分析表明,BmCPV的不同株系与LdCPV-1、DpCPV-1聚为一类.     

广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因 克隆与序列分析

[目的]了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)毒株gp64基因的保守性,并掌握其具体的突变位点,为研究核型多角体病毒(NPV)种内的微进化模式提供参考依据.[方法]对广西不同桑蚕产区的19株BmNPV毒株进行gp64基因克隆与测序,分析完整开放阅读框(ORF)序列的同源性和单核苷酸多态性,并构建基于gp64基因的遗传进化树.[结果]广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列不一致,存在1590、1593和1599 nt三种类型,是由于第94~96位缺失GCG或第97~102位插入GCGCCG所致,且插入核苷酸突变仅在广西BmNPV毒株中出现.仅GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%,其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在98.7%~99.6%.19株广西BmNPV毒株被分为两个亚群(cladeⅠ和cladeⅡ),其中11株独立形成cladeⅡ,7株独立形成cladeⅠ中的一个亚群;广西毒株在多个位点出现同义核苷酸突变,呈一定的规律性.[结论]广西BmNPV毒株的gp64基因具有遗传多样性,在遗传进化上较独立,插入突变显示出地域特点.     

鹅细小病毒河北株HBZF07 VP2基因的克隆与遗传变异分析

采用PCR技术,对鹅细小病毒（GPV）河北分离株HBZF07的VP2基因进行了克隆与测序,并与Gen-Bank中收录的GPV DY株、B株、HG5/82株和GD株进行了核苷酸同源性比较,绘制了基因进化树。结果表明：河北分离株HBZF07的VP2基因长1 772 bp,包含完整的VP2开放阅读框（1 764 bp）,编码587个氨基酸。与GenBank中其他毒株的VP2基因核苷酸序列相比,与DY（EF515837）的同源性为90.8%,与B（GPU25749）的同源性为96.5%,与HG5/82（AY506547）的同源性为95.4%,与GD（AY512830）的同源性为95.4%。说明该毒株与其他参考毒株的亲缘关系较为密切,同时亦表明GPV的VP2基因是高度保守的。研究结果可为其他学者研究GPV VP2基因相关特性提供科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析

以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株为材料，采用RT－PCR扩增其ORF5基因全长cDNA并进行序列测定和比较分析。结果YA株ORF5基因cDNA编码区长603bp，可编码200个氨基酸残基。与欧洲型代表株LV株、美洲型代表株VR－2332株在氨基酸水平上的同尖性分别为58％和90％，与国内首株分离株(CH－1a)的同源性高达95％，推测YA株属于美洲型。根据YA株ORF5基因编码的氨基酸序列，与具有代表性的12株美洲型毒株和2株欧洲型毒株绘制进化系统树，结果也显示YA株与美洲型分离毒株的遗传关系较近，而与欧洲毒株的遗传关系较远。进一步采用序列分析软件对推导的氨基酸进行比较分析，发现YA株ORF5编码的E蛋白存在5个潜在的N－糖基化位点，6个抗原位点，其糖基化位点的数目及抗原位点的分布与其它美洲毒株均存在一定程度的差异，但3个最主要的抗原表位相对保守。     

华南地区新城疫病毒WS99株HN基因片断的克隆和序列分析

用RT－PCR一步法扩增了华南地区野毒NDV WS99株的HN基因890bp片断，并对其进行克隆、核苷酸测序及同源性分析。结果表明：WS99株的HN基因与其他29株NDV的核苷酸同源性在88．0％－99．8％之间，氨基酸同源性在90％－97％之间。鸡源NDV WS99株与鹅源副粘病毒GPMV株有极高的同源性，高达99．8％。该毒株与TEX／48和B1／47一样，在HN基因1301bp处由G突变为A，对应氨基酸由V突变为I，但其半胱氨酸位点和个数没有改变，且所克隆的目的片段中含有HN基因上5个凝血抗原位点其中的4个。     

伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列分析

应用PCR方法从PRV SH（上海株）病毒培养物扩增了gG基因，克隆入pCDNA3质粒，并进行了序列测定。结果表明，扩增的gG基因片段长1719bp，包含一个1491bp的开放阅读框（ORF），在起始密码子上海有TATAAAA盒。在终止密码子下游有AATAAA的poly(A)尾，编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice株相应的gG片段相比，核苷酸序列同源性达97.1%。但推导的氨基酸序列同源性仅有87.6%。主要是在编码区内插入和缺失核苷酸。出现了突变和移码，导致氨基酸序列同源性降低.gG具有膜蛋白的结构特点。     

东方蜜蜂微孢子虫DNA拓扑异构酶Ⅲ的分子特性与系统进化分析

利用相关生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的DNA拓扑异构酶3(DTⅢ)进行了理化性质、分子特性、保守基序、结构域和系统进化的分析。结果表明：DTⅢ包含805个氨基酸,分子式为C₄₂₆₇H₆₇₁₉N₁₁₁₇O₁₂₄₀S₃₄,分子质量约为94.60 ku,脂溶系数为81.84,等电点为9.08,平均亲水系数为-0.595,亲水氨基酸多于疏水氨基酸,不含典型信号肽;含有41个丝氨酸磷酸化位点,23个酪氨酸磷酸化位点及14个苏氨酸磷酸化位点;包含310个α-螺旋,117个β-折叠,37个β-转角及341个无规则卷曲;可同时定位于细胞核、细胞质和线粒体;东方蜜蜂微孢子虫与其他10种微孢子虫的DTⅢ均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)和2个相同的结构域(Toprim和Topoisom＿bac);通过Mega 11.0软件构建东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的DTⅢ的系统进化树,结果显示东方蜜蜂微...     

猪传染性胃肠炎病毒SC-H株M基因的克隆与序列分析

参照Genbank已发表的TGEV的核酸序列设计一对扩增M基因的引物,经RT-PCR扩增了SC-H株的M基因cDNA片段,插入pMD18-T构建重组质粒pMD-M,对pMD-M进行了酶切鉴定及核苷酸测序,将M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考毒株进行了比较分析。结果表明SC-H株M基因扩增片段长度为852bp,包含789bp的M基因编码区,编码262个氨基酸;SC-H株与TS、96-1933、FS772/70、HN2002、TFI、Purdue及TO14株的M基因核苷酸序列同源性为97.8%、94.2%、97.2%、97.8%、99.7%、96.8%及98.2%,氨基酸同源性为96.6%、92.0%、95.4%、96.6%、99.2%、95.8%及97.7%,表明不同毒株的M基因高度保守,系统进化分析显示SC-H株与Prudue株有较近的亲缘关系。