春兰 × 大花蕙兰杂种AGL6同源基因的克隆及其功能研究

 以春兰 × 大花蕙兰杂种试管苗形成的花蕾为材料,利用RACE技术克隆到AGL6基因的全长cDNA,命名为CgAGL6（在GenBank中登录号为GQ265900）。序列分析表明,CgAGL6包含一个完整的ORF,长度为729 bp,编码242个氨基酸;含有AGL6基因所共有的2个保守结构域MADS-box和K-box。通过蛋白序列比对,发现CgAGL6与玉米的ZmZAG3、水稻的OsMADS6有70%的相似性,与拟南芥的AtAGL6有61%的相似性。蛋白质同源性分析表明CgAGL6属于AGL6分支中单子叶植物的分类群。将CgAGL6置于CaMV 35S启动子控制下在烟草中异位表达,转基因烟草表现出开花时间提前,雄蕊部分花瓣化,花粉发育不良和花瓣数增多或减少等新表型,表明CgAGL6参与了转基因烟草开花时间的调控及花器官的发育。     

蕙兰B类MADS-box基因的克隆及表达分析

 采用RT-PCR结合RACE技术从蕙兰（Cymbidium faberi）中分离到3个B类MADS-box基因CfGLO、CfDEF1和CfDEF2,分别编码210、222和227个氨基酸。系统进化树分析显示,CfGLO属于PI/GLO类基因,CfDEF1和CfDEF2分别属于PaleoAP3组基因的PeMADS2类基因和PeMADS3类基因。RT-PCR和实时荧光定量表达分析表明,CfDEF1在2、3轮花器官侧瓣、唇瓣和蕊柱中强烈表达,在萼片中不表达;CfDEF2在1、2、3轮花器官中都表达,在营养组织中不表达;而CfGLO在所有组织中都表达,说明3个基因在蕙兰花器官的形成过程中可能扮演着不同的角色。此外,3个基因都在蕙兰幼嫩子房中有表达,显示其可能在蕙兰子房的形成过程中起一定作用。     

茄子单性结实差异表达序列鉴定及分析

利用实时荧光定量PCR技术,研究茄子单性结实SSH-c DNA文库中的96条EST序列在单性结实自交系和非单性结实自交系果实发育过程中的表达模式。分析表明,在低温条件下,相对表达量有显著差异的EST序列有31条,总体上调表达的EST序列有17条,总体下调表达的EST序列有14条。通过NCBI对EST序列进行Blastx比对,得到与其同源性高的序列信息。其中5条EST与抵御低温相关,6条EST与植物激素代谢相关,多条EST与植物代谢过程中的蛋白质和碳水化合物合成相关,1条EST无比对结果,可能为新基因。差异表达序列可作为研究茄子单性结实和耐低温的候选基因。     

荔枝胚败育差异表达基因cDNA 片段的克隆及序列分析

 利用抑制消减杂交(Suppressive subtraction hybridization , SSH) 克隆荔枝败育胚的差异表达基因cDNA 片段。分别以荔枝‘桂味’正常发育胚为driver (驱赶子) , 败育胚为tester (检测子) , 建立差异表达cDNA 文库, 代表桂味败育胚特异表达的cDNA。经Virtual Northern 检测, 在桂味正常发育胚/ 败育胚差异表达cDNA 文库中得到3 个阳性克隆, 序列分析表明这3 个克隆对应的两个序列在荔枝中为首次报道。     

大白菜杂交种和亲本之间基因表达差异分析

利用cDNA-AFLP技术研究大白菜白引2号杂交种及其亲本在幼苗期、莲座期、结球期的基因差异表达。结果表明：在3个发育期,发现有29条差异片段,其中5个差异片段出现在幼苗期,14个差异片段出现在莲座期,10个差异片段出现在结球期|19个差异片段在杂种中表达,3个差异片段在双亲中同时表达,2个差异片段仅在母本中表达,5个差异片段仅在父本中表达。将29个差异片段的序列在白菜基因组序列数据库网站（http://brassicadb.org/brad/）进行BLAST分析,均找到了对应的染色体位置。其中17个差异片段分别有明确的基因及编码蛋白与其相对应。其中有两个基因片段分别含有AP2/EREBP结构域和PPR结构域,这两个结构域在控制植物生长发育方面具有重要作用。     

'白核'龙眼种子败育不同时期差异蛋白分析

以'白核'龙眼种子为试验材料,比较两种蛋白质的提取方法,确定了酚抽法提取龙眼种子蛋白.应用蛋白质组学研究技术,分析了龙眼种子败育4个不同时期的蛋白质组变化,共发现21个差异蛋白,其中9个上调表达,12个下调表达.通过MALDI/TOF/TOF-MS/MS质谱分析和蛋白质数据库检索,共鉴定出12个差异蛋白,分别为胞质苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、RuBisCO大亚基结合蛋白α、β亚基、17 kD HSP、抗坏血酸过氧化物酶、胞质抗坏血酸过氧化物酶、半胱氨酸蛋白酶、Dessication-related protein以及两个未知蛋白.这些鉴定出的差异蛋白质与能量和物质代谢、分子伴侣功能、自由基清除和抗氧化作用、细胞凋亡等生理过程密切相关,可能参与了龙眼种子败育过程.     

北柴胡鲨烯合酶基因及其编码区cDNA克隆与序列分析

鲨烯合酶(EC.2.5.1.21,squalene synthase,SS)是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。为研究鲨烯合酶在柴胡皂苷生物合成中的作用,以北柴胡(Bupleurum chinense DC.)不定根为试材,采用Trizol法提取总RNA,利用RT-PCR方法从北柴胡中扩增出了鲨烯合酶cDNA特异片段,并进行了克隆、测序。测序结果显示得到了两个序列不同的cDNA(BcSS1和BcSS2),分别为1245bp和1248bp,分别编码414及415个氨基酸。BcSS1和BcSS2间的核苷酸和氨基酸一致性分别为98%和96%。NCBI Blastx结果显示与三岛柴胡和三七SS氨基酸序列相似性最高,BcSS1的一致性分别为99%和90%,BcSS2的分别为97%和87%。在此基础上,利用PCR技术从北柴胡不定根中扩增得到了一个SS基因克隆,长5880bp,包含12个内含子。     

资阳香橙根cDNA全长文库的构建及EST分析

以资阳香橙根RNA为材料,采用SMART技术构建了cDNA全长文库,并对其质量进行鉴定.结果显示,该文库的库容量为4.8×105pfu/mL,重组率为93%,文库插入片段大小主要集中在0.5～1.0kb.从文库中随机挑取450个克隆进行5′端单向测序,去除载体序列及低质量的序列后,共获得有效长度大于150 bp的高质量ESTs(expressed sequence tags)序列438条,利用BioEdit软件对有效ESTs序列进行片段重叠群分析和拼接后,获得251个独立基因(Unigenes),其中包括87个片段重叠群(Contigs)和164个独立的ESTs(Singlets);通过与NCBI的非冗余核酸数据库进行tBLASTx比对,初步确定已知功能基因146个,未知功能基因91个,另有14个unigene未与数据库中序列匹配.该研究为进一步分离克隆资阳香橙根部功能基因奠定了基础.     

橡胶树死皮病黄色体差异表达蛋白的初步分析

橡胶树"死皮病"给橡胶种植业带来严重的危害.为了更好地了解和阐明死皮病发生、发展的分子机制,研究应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophshiya/oresis,2-DE)比较橡胶树死皮株与健康株胶乳黄色体蛋白质组表达的差异.采用TCA/丙酮沉淀法提取橡胶树死皮株与健康株黄色体蛋白质并采用固相pH梯度(immobjlized pH graalient,IPG)双向凝胶电泳分离两种材料蛋白质,凝胶经银染显色后,用PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质.成功获得橡胶树死皮株与健康株胶乳黄色体的双向凝胶电泳图谱.鉴定出13个蛋白差异点,其中10个上调表达,3个下调表达.并应用质谱技术鉴定了其中部分表达差异的蛋白质点,对渗调蛋白进行功能分析,认为渗调蛋白在死皮株中表现下调的情形可能与死皮病的发生有一定的关系.     

白菜翻译起始因子eIF(iso)4E.a/c与芜菁花叶病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析

为阐明白菜翻译起始因子异构体eIF(iso)4E的表达特性,以及该异构体与芜菁花叶病毒(TuMV)的互作关系,在白菜‘极早春’中克隆了eIF(iso)4E.a基因,在‘BP8407’中克隆了eIF(iso)4E.c基因。这两个基因长度一致,均编码200个氨基酸。酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明:eIF(iso)4E.a仅与TuMV-C4株系互作,而不与TuMV-UK1株系互作;eIF(iso)4E.c仅与TuMV-UK1株系互作,而不与TuMV-C4株系互作。对白菜eIF(iso)4E蛋白氨基酸序列及空间结构分析发现:eIF(iso)4E蛋白包含帽结合蛋白结构,eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c蛋白间存在20个差异氨基酸,其中17个差异氨基酸位于帽结合蛋白结构上;TuMV-C4 VPg与TuMV-UK1 VPg蛋白有4个氨基酸差异位点。通过对TuMV不同株系的VPg蛋白(病毒基因组连接蛋白)氨基酸序列频率分析发现,在4个氨基酸差异位点处,氨基酸的使用频率具有选择性。