惠阳胡须鸡IFN-α基因克隆和序列分析

根据红色原鸡IFN－A基因设计了引物对，采用PCR法克隆并测序了我国地方标准品种惠阳胡须鸡的IFN－α基因，定名为HyIFNA4.HyIFNA4与红色原鸡类IFN－α比较，FORF长度均为582个核苷酸，编码162个氨基酸，相互间同源性在97．4％－99％。UPGAM法构建鸡IFN基因系统树进一步揭示了HyIFNA4可能是一种新亚型干扰素。     

惠阳胡须鸡IFN-α、IFN-β基因在大肠杆菌中的表达及其抗病毒活性比较

构建了惠阳胡须鸡IFN-α/pGEX-6P-1I、FN-β/pGEX-6P-1的重组质粒,并在BL21中表达,对重组蛋白进行了抗病毒活性测定,结果表明IFN-αI、FN-β重组蛋白的抗病毒活性分别为7.9×105U/mg和6.4×104U/mg,IFN-α的抗病毒活性是IFN-β的12倍。IFN-αI、FN-β与干扰素受体具有不同的结合位点和结合途径可能是使IFN-α和IFN-β的生物学活性存在较大差异的原因。     

惠阳胡须鸡和AA肉鸡IFN-β基因的克隆与序列分析

克隆了惠阳胡须鸡和AA肉鸡IFN-β基因，与Genbank上白色来航鸡IFN-β序列核苷酸同源性分别为99．84％和100％，没有形成新的亚型。二级结构预测表明鸡IFN-β与IFN-α都是全α螺旋蛋白，但α螺旋的长度和组成螺旋的氨基酸上有差别；BLAST结果表明其三级结构与人IFN-β的三级结构最为相似。这对于理解IFN-α、IFN-β与其受体结合方式的不同与他们的生物学活性差异之间的关系奠定了基础。     

重组鸡α-干扰素的表达与抗病毒活性分析

为了表达具有抗病毒活性的重组鸡α-干扰素(IFN-α),试验根据大肠杆菌密码子的偏好性,对鸡IFN-α的成熟肽基因序列进行优化,合成后连接至原核表达载体pET30a-ELP,经体外诱导后表达重组蛋白ELP-ChIFN-α,借助重复可逆相变循环(ITC)法进行纯化;纯化蛋白经过变性、复性处理后进行安全性评价,采用微量细胞病变抑制法在犬肾细胞(MDCK)/水疱性口炎病毒(VSV)系统中进行蛋白抗病毒活性的检测。结果表明：合成的重组鸡IFN-α成熟肽基因能在原核表达系统中成功表达;不同浓度的重组蛋白ELP-ChIFN-α对细胞的生长抑制率为0;重组蛋白ELP-ChIFN-α在MDCK/VSV系统中具有抗病毒活性,活性为1.2×10⁶ IU/mg。说明原核表达的重组鸡IFN-α有较好的抗病毒活性,可作为鸡的抗病毒生物药物进一步开发研究。     

牦牛IFN-α基因的克隆表达及抗病毒活性研究

从我国地方品种环湖型牦牛和野牦牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,PCR产物酶切后与载体pQE30连接,构建重组质粒pQE30/BoIFN-α,将其转化JM109E.coli并用IPTG进行诱导表达。序列分析表明,环湖型牦牛和野牦牛IFN-α成熟肽基因全长均为498个核苷酸,编码166个氨基酸,其中环湖型牦牛IFN-α与已报道的8个BoIFN-α亚型氨基酸的一致性为92.8%~95.2%,野牦牛为88.6%~92.8%,均为BoIFN-α新亚型。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,重组蛋白约为20kD,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的25%。经包涵体提取、尿素变性和复性后,重组牛IFN-α粗提物在MDBK/VSV和CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性分别为1.6~1.8×106U/mg和2.3×105U/mg,而且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)也有一定的抑制作用。     

具抗病毒活性的重组牛IFN-αA的冷激诱导表达与鉴定

为了在E.coli表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素蛋白(rBoIFN-α),本研究通过PCR扩增牛α干扰素A亚型(BoIFN-αA)基因,并在其上游连接内含肽(SDI)序列,克隆于pColdⅢ中构建内含肽-冷激表达重组质粒pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α,16℃低温诱导表达。结果表明,rBoIFN-α实现了高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,经Ni柱纯化后得到浓度为0.12 mg/mL的目的蛋白。经MDBK-BVDV干扰素活性检测系统检测显示,表达的rBoIFN-α抗病毒活性为9.86×105U/mg。本研究结果为具有抗病毒活性的rBoIFN-α后续应用研究奠定了基础。     

晋南黄牛IFN-α基因的克隆、表达及抗病毒活性研究

本研究通过PCR从晋南黄牛(Yellow cattle)基因组DNA中克隆了IFN-α(BoIFN-α)基因,PCR产物酶切后直接与载体PQE30连接,构建重组质粒PQE30/BoIFN-α,进行测序和诱导表达.测序结果表明,晋南黄牛IFN-α基因全长498个核苷酸,含一个开放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与所报道的BoIFN-α 8个亚型中D亚型最接近,氨基酸序列同源性为97.0%.表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,表达出20kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的20%,表达产物以包涵体形式存在,包涵体占沉淀蛋白的35%.包涵体提取物用8 M尿素溶解变性,经尿素和PBS透析复性后初步纯化.重组牛IFN-α(rBoIFN-α)初提物在MDBK-VSV和CEF-VSV上的活性分别为2.3～6.5×106U/mg和1.3～4.1×105U/mg,对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)有一定的抑制作用,抗病毒效价达到8.2×105U/mg.结果显示大肠杆菌可以高效表达具有生物学活性的rBoIFN-α.     

猪IFN-α14的表达、纯化及抗病毒活性分析

干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子,目前已经应用于多种人和动物病毒病的预防和治疗。不同猪干扰素亚型的抗病毒活性差异较大,为了解猪IFN-α14的抗病毒活性,将猪IFN-α14基因序列进行分析,去除信号肽、优化密码子,并采用基因合成的方法合成了猪IFN-α14亚型基因,将其克隆入pCSMH原核表达载体,优化诱导条件,利用Ni琼脂糖凝胶纯化柱进行亲和层析,获得高纯度的重组猪IFN-α14蛋白,Western blot检测证明重组蛋白具有较好的特异性。用不同浓度的重组猪IFN-α14处理Vero细胞后,接种1 000 TCID₅₀猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV),24 h收集细胞和上清,通过荧光定量检测细胞内病毒的RNA水平,同时测定细胞上清中病毒的TCID₅₀。猪IFN-α14蛋白被成功表达并纯化,证明了10μg/L的重组猪IFN-α14干扰素能够显著抑制PEDV的复制。与本实验室前期表达纯化的猪IFN-α2、8相比,猪IFN-α14抑制P...     

益生菌对惠阳胡须鸡的生长性能和屠宰性能的影响

本试验旨在研究益生菌（丁酸梭菌和粪肠球菌）对惠阳胡须鸡的生产性能和屠宰性能的影响。选取6 000只健康、体重均匀的70日龄的胡须鸡仔鸡,随机分成4组,分别为对照组、粪肠球菌组、丁酸梭菌组、粪肠球菌和丁酸梭菌混合组。试验鸡饲养于同一鸡舍中,所有试验肉鸡均采用相同饲养管理方法,在相同环境下进行饲养,自由饮水和采食。试验结果表明：与对照组相比,丁酸梭菌组平均总增重有所增加,混合组在12、13和15周龄的体重显著提高（P <0.05）,平均总增重高于其他组,饲料转化率有较大提高;在屠宰性能方面,丁酸梭菌组的宰前体重、半净膛重和胸肌重显著提高（P <0.05）,混合组胡须鸡的宰前体重、屠体重和半净体重有极显著提高（P <0.01）,而全净膛重、胸肌重和脚重有显著提高（P <0.05）。由此可见,在胡须鸡的日常饮水中添加丁酸梭菌制剂和粪肠球菌制剂对胡须鸡的生长性能和屠宰性能具有良好的改善作用。     

水貂IFN-α基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR的方法克隆得到干扰素α基因(IFN-α),将IFN-β成熟肽插入原核表达载体pET32a,在E.coliBL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白。结果表明IFN-β片段长564 bp,与已报道的水貂干扰素-α基因相比同源性98%。IFN-α成熟肽可编码166个氨基酸。重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子量约为36 ku,与预期结果相符。     

3种植物添加剂对惠阳胡须鸡肌肉氨基酸、脂肪酸组成与含量的影响

本试验旨在研究绿茶粉、桑叶粉和大蒜粉对鸡肌肉中氨基酸、脂肪酸含量和组成的影响,为植物添加剂在惠阳胡须鸡生产中的应用提供理论依据。选取120只120日龄体重相同、健康的惠阳胡须母鸡,随机分成4个处理,每个处理3个重复,每个重复10只。试验Ⅰ组,饲喂基础日粮+2%绿茶粉;试验Ⅱ组,饲喂基础日粮+4%桑叶粉;试验Ⅲ组,饲喂基础日粮+1.5%大蒜粉;对照组,饲喂基础日粮,预试验7 d,正式试验30 d。饲养试验结束后,每个处理随机选取10只鸡进行屠宰。每只屠宰鸡取同一部位胸肌100 g,通过氨基酸自动分析仪测定肌肉中氨基酸的组成和含量,通过气相色谱仪测定肌肉中脂肪酸的组成和含量。试验结果表明：①日粮中添加植物添加剂对肌肉中氨基酸的组成没有影响,但对肌肉中氨基酸的含量有影响,试验组必需氨基酸含量均显著高于对照组（P<0.05）;②日粮中添加植物添加剂对肌肉中脂肪酸的组成没有影响,但对肌肉中脂肪酸的含量有影响,对照组总饱和脂肪酸含量显著高于3个试验组（P<0.05）,而3个试验组总多不饱和脂肪酸含量/总饱和脂肪酸含量的比值显著高于对照组（P<0.05）。本试验结果表明,日粮中添加植物添加剂不影响肌肉中氨基酸和脂肪酸的组成,但影响肌肉中两者的含量,显著降低鸡肌肉中饱和脂肪酸的含量,提高多不饱和脂肪酸的比例,增加必需氨基酸含量。因此,日粮中添加植物添加剂可改善惠阳胡须鸡肌肉品质。     

荷斯坦奶牛IFN-α基因的克隆表达和抗病毒活性分析

本研究通过 PCR从荷斯坦奶牛基因组 DNA中克隆了 IFN- α(Bo IFN- α)基因 ,PCR产物双酶切后与载体 PQE30连接 ,构建重组质粒 PQE30 /Bo IFN- α,进行测序和诱导表达。测序结果表明 ,荷斯坦奶牛 IFN- α基因全长为 4 98个核苷酸 ,含一个ORF,编码 16 6个氨基酸的成熟蛋白 ,与所报道的 Bo IFN- αA亚型只存在一个点变异。表达产物经 SDS- PAGE和 Western blot分析 ,表达出 2 0 KD的融合蛋白 ,表达量占菌体总蛋白的 2 2 % ,表达产物以包涵体形式存在 ,约占沉淀蛋白的 32 %。包涵体提取物经尿素变性、透析复性后初步纯化 ,重组牛 IFN- α(r Bo IFN- α)初提物在牛肾细胞 (MDBK) /水泡性口炎病毒 (VSV)和鸡胚成纤维细胞 (CEF) /VSV细胞系上的活性分别为和 1.0～ 2 .3× 10 6 U/mg和 1.3～ 2 .6× 10 5U/mg,对传染性牛鼻气管炎病毒 (IBRV)感染有一定的抑制作用 ,抗病毒活性为 7.8× 10 5U /mg。结果显示大肠杆菌可以高效表达具有生物学活性的 r Bo IFN-α。     

鸭IFN-α成熟肽基因的原核表达、复性及其抗病毒活性研究

为获得鸭α-干扰素（DuIFN—α）并研究其生物学功能,将DuIFN-α成熟蛋白基因与原核表达载体pET32a＋连接后转化到BL21（DE3）获得工程菌BL21（DE3）／pET32a＋DuIFN—α,对其表达产物的纯化和复性关键技术及其抗水疱性口炎病毒（VSV）、鸭瘟强毒（DPV）活性进行研究。结果表明：BL21（DE3）／pET32a＋-DuIFN-α经0．4mmol／LIPTG诱导获得高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量约37ku,以包涵体形式存在;重组蛋白经镍金属螯合介质（Ni—MIAC）进行纯化和复性后获得理想效果,其抗VSV活性的比活力达到12800U／mg;利用定量PCR检测到15U／mL的重组DuIFN-α对鸭瘟强毒表现出抑制作用,为重组DuIFN—α的临床应用提供试验数据。     

重组扬州鹅IFN-α的表达与活性研究

为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoIFN-α)免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,westernblot检测抗体特异性。同时,将IFN-α全长基因克隆至pcDNA3.1(-)以构建pcDNA-GoIFN-α,间接免疫荧光试验检测rGoIFN-α在鹅胚成纤维细胞(GEF)中的表达,细胞病变抑制法检测其抗水泡性口炎病毒(VSV)活性。结果显示:本研究扩增得到576bp的扬州鹅IFN-α全基因与486bp的成熟基因片段;原核表达的mGoIFN-α为36.3ku,免疫小鼠后可产生具有良好特异性与抗原活性的多克隆抗体,效价为1:16000;pcDNA-GoIFN-α可在GEF中表达,并具有较高的抗VSV活性。本研究为制备安全、高效的重组鹅干扰素,为研制鹅病毒性疾病的新型生物制剂奠定了基础。     

鸡IFN-α基因的多点突变及其在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性,在不改变其编码的氨基酸序列的前提下,对鸡IFN-α序列进行PCR介导的定点突变优化,将鸡IFN-α成熟肽序列中136～143位相近的4个Arg密码子和N端的6个稀有密码子突变为毕赤酵母高表达优越密码子,构建了含正确突变和未突变序列的克隆载体pMD-IFNm、pMD-IFN和酵母表达载体pPICZ-IFNm、pPICZ-IFN,电击转化毕赤酵母X-33菌株,经筛选、鉴定表明鸡IFN-α基因已整合到酵母基因组中.通过表达产物的抗病毒活性测定,筛选出突变与未突变高表达酵母转化子各1株.经密码子优化的突变重组酵母菌株PP-IFNm于BMMY培养基中诱导72 h上清中抗病毒活性单位可达410U/mL,其活性比未优化重组酵母株PP-IFN(48.33U/mL)提高了约10倍.     

鸡α干扰素基因的原核表达及其活性测定

应用RT-PCR技术,从被刺激诱导的鸡脾脏淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素(ChIFN-α)基因cDNA,经克隆和测序后,构建原核表达重组质粒pGEX-proChIFN-α(全长序列)和pET-ChIFN-α(不含信号肽序列),并分别转化相应的表达菌.重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,ChIFN-α基因均获得表达,重组蛋白大小分别为45 ku、26ku左右,表达的蛋白以包涵体形式存在.表达产物经变性、提纯、复性,重组蛋白的含量约为1 mg/mL.复性后的ChIFN-α能够在鸡胚成纤维细胞上抑制H5N1禽流感病毒的复制;用水泡性口炎病毒检测结果表明,重组ChIFN-α具有较高的抗病毒作用,其生物学活性达到2×106 u/mg.     

猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析

为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析.结果显示,猫IFN-α有21个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化位点和...     

鸡Mx基因的原核表达及表达蛋白抗病毒活性初步研究

将鸡Mx基因克隆入pET一32a载体,筛选鉴定后将重组阳性质粒转化到大肠埃希菌株BL21进行诱导表达,表达产物用west,ern blot鉴定,并经镍亲和层析法纯化及透析复性,得到的蛋白用微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性.结果显示,构建的载体经PCR扩增得到长度为2 118 bp的特异片段,测序结果证实与鸡Mx基因同...