应用单克隆抗体检测大麦黄花叶病毒

作者应用已建立的大麦黄花叶病毒(BaYMV)的4F_(10)单克隆抗体杂交瘤细胞株,经小白鼠腹水生产单克隆抗体,用过碘酸钠法制备了辣根过氧化物酶标记的酶标单克隆抗体。并由此建立了检测大麦黄花叶病毒的标准的双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)。其检测提纯病毒的灵敏度为3.0μg/ml左右,感病大麦叶片汁液的最大稀释度为1:2560,病茎稀释度为1:160。对采自我国7个主要BaYMV发病区感病的样品进行了检测,绝大多数均显示强阳性,只有宝山样品例外。本项试验为BaYMV诊断的标准试剂盒的建立进行了有益的尝试。     

一种豇豆重花叶病毒RT-PCR检测方法的研究

对一种豇豆重花叶病毒(Cowpeas evere mosaic virus,CPSMV)反转录PCR分子检测方法进行了研究。利用从美国菌种保藏中心和德国微生物毒株保藏中心引进的CPSMV标准毒株,设计了一对特异性简并引物(CPSMVf/CPSMVr),建立了CPSMVRT-PCR检测方法。该方法具有良好的扩增反应及特异性,灵敏度可达1pg的总病叶组织RNA量。CPSMV双抗夹心酶联免疫法(DAS-ELISA)灵敏度为10μg叶组织。该方法适用于豇豆等豆类蔬菜种子及种苗中对豇豆重花叶病毒的快速检测。     

进境番茄种子中番茄花叶病毒的检测与鉴定

利用双抗夹心 酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)和反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR）方法对来自韩国的番茄种子进行种传病毒检测。结果表明,在该批番茄种子中检测到番茄花叶病毒（ToMV）和烟草花叶病毒（TMV）。PCR产物测序结果表明,ToMV特异引物（ToA/ToB）与TMV特异引物（TA/TB）扩增的片段均为ToMV的外壳蛋白（CP）基因及3′非编码区（3′ UTR）,该片段与其他ToMV分离物的核苷酸序列相似性为98.2%~99.9%。本研究利用重新设计合成TMV和ToMV特异引物对该批种子进行RT PCR检测,仅ToMV特异性引物（ToMf1/ToMr1）扩增到670 bp的预期片段,TMV特异引物（TMf1/TMr1）则未出现特异性扩增,表明重新设计的引物可准确区分ToMV和TMV。以上结果证实该批番茄种子仅携带ToMV。     

进境荷兰郁金香种苗中南芥菜花叶病毒的鉴定

为了防止南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)传入我国,采用血清学、分子生物学、电镜观察及生物学接种等方法对从荷兰进口的郁金香种苗进行了ArMV检测。结果表明:ArMV血清学反应为强阳性;RT-PCR反应扩增出370bp的特异性目标条带;RT-PCR产物与已报道的3个ArMV部分外壳蛋白基因的核苷酸序列同源性为91.00%～93.24%,氨基酸序列同源性为99%～100%;免疫电镜观察到叶片病汁液中含有直径约30nm的球状病毒粒体;该病毒在黄花烟、白肋烟、矮牵牛和昆诺藜等鉴别寄主上引起坏死和褪绿等典型症状,经DAS-ELISA检测,这些接种寄主均呈ArMV血清学阳性反应。故将该病毒鉴定为南芥菜花叶病毒。     

加拿大进口大麦中小麦线条花叶病毒检疫鉴定

小麦线条花叶病毒(WSMV)是我国进境植物检疫性有害生物。2018年5月秦皇岛海关利用反转录PCR(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA), 从加拿大进口的大麦中检出WSMV。同时利用实时荧光定量PCR (Real time RT-qPCR)和序列比对分析方法进行了验证。这是我国首次在进境加拿大大麦中截获WSMV。     

进境美国小麦中小麦线条花叶病毒检疫鉴定

小麦线条花叶病毒(WSMV)是我国进境植物检疫性有害生物。2016年11月天津出入境检验检疫局通过反转录PCR(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法,从美国小麦中检出WSMV。利用实时荧光PCR(Realtime RT-PCR)、免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)和序列比对分析等方法进行了验证。这是我国在进境小麦中截获WSMV的首次报道。     

粉虱传双生病毒的TAS-ELISA及PCR快速检测

 利用粉虱传双生病毒(WTGs)多克隆抗体及单克隆抗体,建立了三抗体夹心ELISA (TAS-ELISA)检测WTGs的方法,并发现了单克隆抗体SCR18可广泛用于我国WTGs的检测。利用根据WTGs基因组上基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列设计的引物,建立了PCR特异检测WTGs的方法。对田间病样的TAS-ELISA和PCR检测表明,粉虱传双生病毒在云南省烟草、番茄和南瓜上均存在,2种方法的测定结果是一致的。     

从海南省杂草胜红蓟和假马鞭上检测到粉虱传双生病毒

 利用三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)及PCR检测的方法对采自海南的胜红蓟(Ageratum conyzoides)和假马鞭(Stachytarphetajamaicensis)的5个病样进行了检测,表明均为粉虱传双生病毒。PCR扩增产物克隆后进行序列测定,结果表明存在2类双生病毒,其中样品Hn2存在2类病毒的复合侵染。这是在海南首次报道存在有粉虱传双生病毒。     

PCR技术检测种传植病细菌研究进展

本文综述了PCR技术在种传植病细菌检测方面近年来的研究进展状况，对各种检测方法进行了比较详细的介绍，着重阐述了种类、原理、灵敏度等方面的研究进展。     

进境百合种球南芥菜花叶病毒的检测及分子鉴定

本研究根据南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)CP基因序列,设计并合成了特异性巢式PCR检测引物,通过第1轮RT-PCR和第2轮PCR扩增得到预期的930bp和260bp的条带,扩增序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在86%～97%的同源性.结果表明百合上分离到的病毒为ArMV,进一步研究也证明巢式PCR灵敏度与普通RT-PCR相比高出了103倍.     

葫芦种子传黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测*

从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）的葫芦植株上收取种子,通过苗期症状观察法、双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）、免疫捕获反转录PCR（IC-RT-PCR）法测定葫芦种子的带毒情况,并用生物学接种方法测定葫芦种子携带病毒的侵染活性。苗期症状观察法结果表明,199株幼苗有2株表现花叶斑驳症状,种子传毒率为1.01%;而利用DAS-ELISA和IC-RT-PCR法随机检测30粒葫芦病株种子,CGMMV检出率为100%。种子各部位携带的CGMMV接种葫芦表现典型的花叶斑驳症状,表明葫芦种子携带的CGMMV具有侵染活性。DAS-ELISA检测葫芦种子CGMMV的灵敏度为1/5120种子研磨液。     

一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒

本文在两步RT-PCR检测ZYMV的基础上进行了一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的实验,并对商品化一步法RT-PCR试剂盒和本文实验的一步法RT-PCR的效果和成本进行了比较,最终建立了一种比较实用的检测ZYMV的方法.     

甘蔗花叶病毒在玉米种子中的分布及其与种子传毒的关系

 采用免疫学、电镜观察、RT-PCR、组织培养及生物学测定等方法,针对引起玉米矮花叶病的甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)在高感自交系Mo17的乳熟期、蜡熟期、成熟期和室温贮存的成熟干种子上的分布部位及其各部位病毒的侵染性进行了研究。结果表明:病毒存在于种皮、胚乳的糊粉层和胚内,糊粉层和胚内的病毒具有侵染活力,胚内的可侵染性病毒可以通过发芽传递给下一代幼苗,完成病毒的种子传播过程。在种皮内没有检测到具有侵染活力的病毒,在胚乳的淀粉层内未检测到病毒。在种子成熟过程中,种子内的病毒不断得到积累,随着种子的脱水、干燥又被部分钝化,使得种子传毒率降低。     

进境玫瑰鲜切花李属坏死环斑病毒的检测鉴定

近期上海口岸连续多次从进境的玫瑰鲜切花中检出我国检疫性有害生物李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV),通过DAS-ELISA、RT-PCR、SYBR Green I实时荧光RT-PCR和序列分析等4种方法分别检测和复验该病毒,结果均为阳性,由此确定从进境玫瑰鲜切花中检出了PNRSV。同时本文分别检测玫瑰叶片、花瓣、茎干和花萼,结果均带有PNRSV,确定该病毒系统侵染玫瑰。     

辽中地区西瓜花叶病病原的分子鉴定

 利用ELISA和RT-PCR方法对采自我国辽中地区的西瓜花叶病样品进行检测,表明其病原为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)。将此分离物(CGMMV-Wcn)的外壳蛋白基因克隆后进行序列分析,结果表明其cp基因由486个碱基组成,编码161个氨基酸,与已报道的其它分离物一致;CGMMV-Wcn所致症状与西瓜株系(CGMMV-W)相同,且二者cp基因的氨基酸序列完全一致,因此该分离物应为CGMMV-W。     

大豆黄化普通花叶病毒的检测及鉴定

随着国际邮寄业务的迅速发展,外来有害生物随邮寄物入侵我国的风险与日剧增。2012年在韩国旅客携带的大豆种子中首次检出南方菜豆花叶病毒属新种大豆黄化普通花叶病毒(Soybean yellow common mosaic virus,SYCMV)后,近日在隔离种植的日本邮寄大豆种子中,通过多种方法再次检出该病毒。本文将详细分析DAS-ELISA,RT-PCR及序列测定分析的过程,以期为种子病毒的检测提供新的思路。     

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and dispersedye immuno assay (DIA): Comparison of simultaneous and separate incubation of sample and conjugate for the routine detection of lettuce mosaic virus and pea early-browning virus in seeds

Two modifications of ELISA and DIA were compared in relation to sensitivity of detection of two plant viruses and suitability for large-scale routine testing. DIA is a solid phase immuno assay like ELISA, in which the enzyme conjugate is replaced by a dye sol conjugate and substrate incubation is replaced by immediate dissolving of the dye molecules from the conjugate with an organic solvent. Sample and conjugate were incubated separately (ELISA 1, DIA 1) or simultaneously (ELISA 2, DIA 2). The seed-borne viruses viz. lettuce mosaic virus (LMV) and pea early-browning virus (PEBV) were subjected to the assays. DIA detected LMV in a purified extract ofNicotiana benthamiana. However, compounds present in crude virus-free and virus-containing plant extracts strongly interfered with DIA, necessitating adaptation of DIA to plant viruses in crude extracts.With the extracts of lettuce and pea seeds ELISA 2, in comparison with ELISA 1, resulted in equal (LMV) or slightly higher (PEBV) extinction values and in a higher ratio between extinction values of virus-containing and virus-free samples. The higher sensitivity of ELISA 2 in combination with its higher efficiency as a result of simultaneous sample and conjugate incubation, indicates the potential of this method for large-scale indexing.Samenvatting Twee modificaties van ELISA en DIA werden vergeleken met betrekking tot hun gevoeligheid voor het aantonen van twee plantevirussen en hun geschiktheid voor routinematige toepassing. DIA is een serologische toetsmethode die veel overeenkomst vertoont met ELISA, maar waarin het enzymconjugaat is vervangen door een conjugaat met gedispergeerde kleurstofdeeltjes en de incubatie met enzym-substraat door het direct oplossen van de kleurstofmoleculen van het conjugaat met een organisch oplosmiddel. Incubatie van monster en conjugaat vond zowel gescheiden (ELISA 1, DIA 1) als gelijktijdig (ELISA 2, DIA 2) plaats. Twee met zaad overgaande virussen, te weten slamozaïekvirus (LMV) en vroege-verbruiningsvirus van erwt (PEBV) werden bij het onderzoek betrokken. Met DIA kon LMV worden aangetoond in een gezuiverd extract vanNicotiana benthamiana. In ruwe planteëxtracten bleken echter stoffen voor te komen die in DIA sterke niet-specifieke reacties tot gevolg hadden. Verder onderzoek is dan ook noodzakelijk om DIA geschikt te maken voor het aantonen van plantevirussen in ruwe extracten van planten. Betere resultaten werden verkregen met de beide ELISA-modificaties. Met de extracten uit slazaad en erwtezaad gaf ELISA 2 vergelijkbare (LMV) of iets hogere (PEBV) extinctiewaarden dan ELISA 1. Bovendien was de verhouding tussen de extinctiewaarden van virusziek materiaal en die van virusvrij materiaal, bij ELISA 2 hoger dan bij ELISA 1. De grotere gevoeligheid van ELISA 2 en de grotere doelmatigheid ten gevolge van de gelijktijdige incubatie van monster en conjugaat duiden op de bijzondere geschiktheid van deze methode voor routinematige toepassing op grote schaal.     

Host differentiation and serological homology of pea seed-borne mosaic virus isolates

Seven isolates of pea seed-borne mosaic virus (PSbMV) were compared on selectedPisum sativum L. differentials and by microprecipitin and SDS-gel serology and particle length. All isolates were characterized by 750 nm particle-length modes and were closely related serologically, but some were readily distinguished onP. sativum differentials. Isolate distinctions were of the magnitude typical for virus strains. Differentials, diversePisum germplasm from U.S. Plant Introduction accessions, provided a practical means of PSbMV strain differentiation.Samenvatting Tussen 1966 en 1970 zijn in verschillende landen virussen gerapporteerd, die bij erwt met zaad overgaan, maar in verschillende opzichten leken te verschillen. Isolaten uit Japan en de USA bleken serologisch nauw aan elkaar verwant, zo niet identiek te zijn. Daarom werd de internationale naam pea seed-borne mosaic virus voorgesteld. In Nederland was het virus beschreven onder de naam erwterolmozaïekvirus.Zeven isolaten van het virus uit de USA, Japan, Tsjechoslowakije en Nederland zijn nader met elkaar vergeleken in reactie op geselecteerde differentiërende rassen van erwt (Pisum sativum) en op enkele andere plantessorten, en in serologische eigenschappen zowel als in deeltjeslengte.Serologisch waren de isolaten niet van elkaar te onderscheiden, wel echter van het verwante bonescherpmozaïekvirus. De voor alle vormen van het laatste virus onvatbare Perfection-type erwterassen bleken al eerder alle vatbaar te zijn voor het erwterolmozaïekvirus. Ook verschillen de isolaten niet in deeltjeslengte (750 nm).Bij toetsing in zes verschillende over de wereld verspreide laboratoria bleek de reactie van de differentiërende erwterassen te variëren van een snelle, de hele plant dodende necrose (groep I) tot onvatbaarheid (groep V). Ook tussen de virusisolaten bestonden kleine verschillen in reactie. Het Nederlandse isolaat E224 gedroeg zich opvallend mild. Ook in de, directe vergelijkingsproeven op enkele toetsplantesoorten bleken kleine biologische verschillen te bestaan. De geconstateerde verschillen overschrijden echter niet die tussen stammen van eenzelfde virus. Wellicht gaat het bij het optreden van necrose en van zwakke symptomen om genen die het vatbaarheidsgensbm modificeren.Contribution of the U.S. Department of Agriculture, Science and Education Administration, Agricultural Research, in cooperation with the Agricultural Experiment Station, Oregon State University, Corvallis. Technical Paper No. 5192, Oregon Agricultural Experiment Station.Mention of a trademark of proprietary product does not constitute a guarantee or warranty of the product by the U.S. Department of Agriculture and does not imply its approval to the exclusion of other products that may also be suitable.Authors are members of the International Working Group on Legume Viruses.     

应用MNP-RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

 A novel RT-PCR method integrated with Magnetic Nano Particles (MNP), MNP-RT-PCR, was set up for detection of Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV). After the virus particles in crude sap were concentrated by MNP, viral RNAs were released and were detected by RT-PCR. CGMMV could be detected in as less as 10 ng watermelon leaf materials. Compared with normal RT-PCR, the method decreased the inhibitors of plant material and steps for extracting RNA, and also increased the sensitivity of RT-PCR detection in less time. The method is simple and suitable for quick detection of plant virus in a large number of samples.