亚麻糖基转移酶基因LuUGT72E1的克隆与表达分析

以亚麻茎部组织总RNA为模版,通过反转录PCR获得糖基转移酶Lu UGT72E1基因的全长开放读码框序列。序列分析结果表明:开放读码框全长1 476bp,共编码491个氨基酸。通过多氨基酸比对发现,该蛋白与亚麻UGT72N2蛋白亲缘关系最近,相似度达99%,与毛果杨、巨桉、木薯、雷蒙德氏棉及拟南芥UGT72E1蛋白的氨基酸序列相似性在58%~51%。分子进化分析表明,该蛋白与拟南芥UGT72E1~3聚为一类,推测该蛋白参与木质素单体的糖基化修饰过程。基因表达谱结果表明,该基因被BR、Brz诱导下调表达。本研究为亚麻的纤维品质改良提供了候选基因。     

毛竹中黄酮-C-糖基转移酶基因的克隆和生物信息学分析

糖基转移酶是催化黄酮糖苷形成的关键酶。黄酮糖苷类化合物具有抗氧化、清除自由基、调节血脂和血糖等生理作用。基于毛竹基因库测序的完成,本研究通过RT-PCR技术首次获得一条完整的毛竹黄酮-C-糖基转移酶基因开放阅读框,将其命名为PeCGT,其基因的序列长度是1342 bp。对其编码蛋白的理化性质、保守结构域以及二级结构和空间结构等进行了生物信息学分析。结果表明:PeCGT基因编码的蛋白含有447个氨基酸,分子量是47.76 kD,理论等电点为4.91,酸性氨基酸(Asp+Glu)个数为54,碱性氨基酸(Arg+Lys)个数为35。PeCGT蛋白是疏水型蛋白,不存在信号肽,存在于线粒体中。结构域预测分析结果表明,PeCGT编码的氨基酸序列具有明显的糖基转移酶特征的保守域结构PSPG。通过同源性分析,其与乌拉图小麦(Triticum urartu)、节节麦(Aegilops tauschii subsp.Tauschii)和二穗短柄草(Brachypodium distachyonhiihii)具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明:PeCGT基因在叶中的表达量最高,在根中几乎不表达,在茎中有部分表达。此研究结果为以后毛竹黄酮-C-糖基转移酶的表达和功能鉴定提供了一定的帮助。     

苦荞漆酶基因的克隆与生物信息学分析

利用RT-PCR技术从苦荞中克隆出2条漆酶（laccase）基因,运用生物信息学技术对2个基因序列进行分析,预测结构域、二级和三级蛋白结构,进行蛋白同源比对及进化树分析。结果表明,FtLAC-1基因序列开放阅读框为1695bp,编码564个氨基酸,FtLAC-2基因序列开放阅读框为1707bp,编码568个氨基酸。FtLAC-1和FtLAC-2蛋白预测分子量分别为61.41和62.47kDa,理论等电点分别为9.45和9.41,为亲水性蛋白,2个基因序列相似性较低,氨基酸序列同源性不高。qRT-PCR分析出其在苦荞不同组织器官存在差异性表达。结论为进一步探索FtLAC-1和FtLAC-2在苦荞薄果壳形成中的功能提供理论基础。     

天然棕色棉葡萄糖苷转移酶基因Gh3GT的克隆与表达分析

本研究以发育18d的天然棕色棉及相同发育时期的白色棉近等基因系纤维细胞为材料,采用抑制性差减杂交结合RACE技术分离得到了一个葡萄糖苷转移酶基因的全长cDNA,命名为Gh3GT(GenBank登录号eu921265)。序列分析发现:该基因编码一条有450个氨基酸残基组成的多肽,含有葡萄糖苷转移酶C-端所特有的保守的信号序列PSPG基序,属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员。推断的Gh3GT编码产物与其它糖苷转移酶同源性比对和系统发生分析表明:该糖苷转移酶与玫瑰Rh3GT(Rosa hybrida)、矮牵牛(Petunia hybrida)PhF3GT以及葡萄VvUFGT(Vitis vinifera)的相似性分别为51.30%、46.94%和45.85%,而与已知的陆地棉糖苷转移酶基因GhUGT1和GhUGT2一致性较低,仅为25.37%和12.14%。半定量RT-PCR分析表明:该基因在棕色棉纤维中的表达量明显高于其它组织及其近等基因系白色棉品种,且其在纤维中的表达规律与棕色棉的色素形成过程一致。     

七叶一枝花糖基转移酶基因的克隆及表达分析

糖基转移酶处于重楼皂苷生物合成途径的最后一步,催化薯蓣皂苷元或偏诺皂苷元的糖基化形成各种重楼皂苷,具有重要的研究价值。本研究通过对七叶一枝花进行转录组高通量测序、表达谱结合含量关联分析,筛选得到1条可能参与重楼皂苷生物合成的糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)候选基因。通过克隆,获得Pp-GT全长基因(GenBank登录号:MW208819),长度为1 443 bp,就Pp-GT的蛋白质序列及进化等进行了生物信息学分析,并对其基因表达模式进行了研究。该研究为下一步重楼皂苷合成途径的阐明和Pp-GT基因的功能验证提供了科学依据。     

小麦糖基转移酶基因TaUGT73D1的克隆及表达分析

为探讨TaUGT73D1基因在小麦花发育过程中雄蕊和雌蕊形成的作用,本研究利用小麦三雌蕊突变体TP和雄蕊同源转化型不育突变体HTS-1两个品种,从中克隆得到了TaUGT73D1(UDP-glycosyltransferase73D1)的3个同源基因TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D,通过基因碱基序列分析表明TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D基因序列全长分别为1 907 bp、1 912 bp、1 905 bp,开放阅读框分别为1 365 bp、1 467 bp、1 461 bp,分别编码454、488、486个氨基酸残基,通过与小麦基因组比对,发现这3个同源基因分别位于染色体2AL、2BL、2DL上。TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D与乌拉尔图小麦Tu UGT73D1的编码区相似度分别为97.68%、96.52%、99.05%,蛋白序列相似度分别为73.57%、95.08%、95.70%。系统进化分析表明,该类基因与单子叶植物的UGT基因聚在一起,表明其亲缘关系较近,而与双子叶植物相隔较远,表明其亲缘关系较远。利用Real-time PCR分析TTaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D基因在不同花器官雌蕊(P)、雄蕊(S)及雌蕊化雄蕊(PS)中表达模式。结果表明,该类基因在雄蕊中表达量最高,在雌蕊及雌蕊化中几乎不表达。因此推测TaUGT73D1基因可能与小麦雄蕊同源转化为雌蕊性状有关。本研究为进一步探讨小麦TaUGT73D1基因的功能提供了理论依据。     

金银花糖基转移酶基因LjUGT71E1的克隆及原核表达

糖基化广泛存在于生物体中,具有非常重要的作用,而糖基转移酶则是催化糖基化反应的关键酶。本研究根据转录组数据库,设计引物从金银花(Lonicera japonica Thunb.)中克隆得到一个糖基转移酶编码基因LjUGT71E1,序列分析表明该基因的CDS为1 503 bp,理论可编码氨基酸数目为501,等电点(p I)预测为5.09,理论分子量为55 579.71 Da。多重序列比对表明LjUGT71E1与其它植物UGT71家族成员在序列上保守性很高,并且其C端具有催化植物次生代谢产物糖基化的糖基转移酶所具有的保守的PSPG-box基序。系统发生分析表明LjUGT71E1与人参(Panax ginseng)和甜叶菊(Stevia rebaudiana)的UGT71E亚家族成员聚为一支。荧光定量PCR分析表明,该基因在金银花的五个花期均有表达,在幼蕾时期相对表达量达到峰值。进一步构建了LjUGT71E1基因的原核表达载体并且在大肠杆菌中诱导表达得到重组蛋白,为后续的功能研究提供了基础。     

马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

为探讨鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase, sgt3)基因与类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)合成关系, 揭示sgt3基因在SGAs合成中的作用, 本研究根据GenBanK No：DQ266437保守区设计特异引物, 通过RT-PCR技术获得马铃薯块茎sgt3相似基因;采用生物信息学相关软件分析, 预测sgt3相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能, 构建基于sgt3基因的植物干扰表达载体。结果表明, 克隆的sgt3相似基因与报道的sgt3基因序列相似性达到99.54%, 其ORF长1 500 bp, 编码505个氨基酸残基, 具有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;三级结构预测表明, 该氨基酸同糖基转移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族成员, 表明可能具有合成类固醇糖苷生物碱功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为HM188447。以此为靶序列, 构建由Actin启动子和CIPP启动子驱动的与sgt1和sgt2基因相似度高的含有sgt3基因序列的干扰表达载体, 将为糖苷生物碱的合成、代谢的进一步研究及低糖苷生物碱转基因马铃薯品种的培育奠定基础。     

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

为深入研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分析表明,随着Na Cl胁迫浓度的增加,FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加,150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大,分别比对照增加了254.10%,311.35%和256.18%;Na Cl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%,145.67%和155.94%,茎基部和叶片的平均表达量较高,说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节,FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。     

苦荞FtC4H基因克隆与生物信息学分析

克隆苦荞苯丙烷类物质代谢途径中的关键酶肉桂酸-4-羟基化酶基因（FtC4H）,为进一步研究其功能奠定基础。以云荞1号和小米荞为材料,提取不同发育期果壳RNA,利用RT-PCR法克隆苦荞FtC4H基因,运用生物信息学分析FtC4H蛋白的特征,构建FtC4H蛋白系统进化树,分析其基因表达。结果表明,克隆的FtC4H基因序列包含1299bp完整的cDNA开放阅读框,编码432个氨基酸,为亲水性不稳定碱性蛋白,具有P450超家族保守域,不具有跨膜结构域,有丰富的二级结构,三级结构预测显示FtC4H与6vby.1.A的序列相似度高。系统进化分析结果表明,本研究克隆的FtC4H与已报道的苦荞其他C4H基因不同。qRT-PCR结果表明,FtC4H在小米荞的花和叶中相对表达量显著高于云荞1号。     

过表达FtbZIP5提高苦荞毛状根黄酮积累及其耐盐性

bZIP转录因子不仅在植物盐胁迫网络中起着重要的作用,还可调节植物类黄酮的积累。在苦荞品种川荞1号中克隆了1个具有转录激活活性的bZIP家族基因FtbZIP5。FtbZIP5基因能被NaCl和脱落酸（ABA）诱导表达,在茎和叶中的表达高于根中。对过表达FtbZIP5基因毛状根的总黄酮含量进行检测,结果显示,总黄酮含量在过表达株系中显著高于野生株系。同时检测其类黄酮合成途径中关键酶基因的表达量,其中黄烷酮-3-羟化酶基因（F3H）的表达量较高。可推测该过表达毛状根株系中总黄酮的积累与F3H的表达有关。在NaCl（100mmol/L）胁迫下,各株系的总黄酮积累受到抑制,过表达株系的含量减少至0.63mg/g。并且,在这种压力下,F3H的表达水平仍然高于对照。植株在受到胁迫后,对照株系的过氧化氢酶（CAT）活性显著低于过表达株系。随着野生型植株受到胁迫的增强丙二醛（MDA）含量增加,但过表达株系的含量趋于稳定。以上结果表明,在过表达FtbZIP5毛状根中,总黄酮的积累可能是通过关键酶基因F3H的上调表达来调节的。并且FtbZIP5可提高苦荞毛状根耐盐性。通过解析FtbZIP5对苦荞毛状根中总黄酮积累及植株耐盐性的影响,为荞麦耐盐性和解析其耐盐机制研究奠定基础。     

苦荞中查尔酮合成酶基因（CHS）的克隆

获得完整的苦荞查尔酮合成酶基因（CHS）信息并评价其进化地位,对分子辅助选育高黄酮含量的苦荞品种具有重要的指导意义。用RACE法克隆苦荞CHS基因,用生物信息学手段分析预测苦荞CHS基本理化性质和同源性,用临接法构建了该酶的系统发生树。获得1250 bp的CHS cDNA全长,含241 bp的3’UTR和185 bp的5’UTR;等电点（pI）和分子量（Mr）分别为5.33和35340.75 Da;克隆获得975 bp的开放性阅读框（ORF）。预测该基因编码含325个氨基酸残基的蛋白,氨基酸同源比对结果表明,苦荞CHS与蓼科的虎杖相似性很高;临接法构建的系统发生树结果表明,苦荞CHS与其他双子叶植物有共同的起源,与蓼科的金荞麦、甜荞、虎杖及石竹科的满天星亲缘关系较近。成功获得苦荞CHS基因的cDNA全长,克隆出完整的ORF,并确定了苦荞中该酶的进化地位和方向。     

苦荞提取物的毒理学安全性

通过给小鼠和大鼠投喂苦荞提取物，观察了苦荞提取物的毒理学安全性。结果表明，苦荞提取物长期连续应用，对大鼠生长发育及血液学、生化、病理指标均未见明显的不良影响，实属无毒。     

苦荞全基因组SSR位点特征分析与分子标记开发

目前苦荞SSR多态性标记数量较少,根据已发表的苦荞基因组测序数据,利用MISA软件对1~6核苷酸重复的SSR位点进行了查找和序列特征分析,批量设计引物并对引物进行了有效性和多态性检测。结果表明,苦荞基因组中共检测到1 640个SSR位点,其中三核苷酸重复型SSR最多,占比63.29%,五核苷酸重复型最少,仅占0.12%。AT/TA、AAG/CTT、ACC/GGT和ATC/GAT为出现频率较高的重复基序。苦荞基因组SSR序列长度变化范围为12~476bp,平均长度23.14bp,长度12~19bp的占比71.71%,长度≥20bp的占比28.29%。根据不同类型SSR位点设计并合成引物479对,选择200对引物对5份苦荞资源和3份甜荞资源进行多态性检测,有56对扩增出多态性条带,17对在苦荞种质中产生多态性条带,48对在甜荞种质中产生多态性条带,9对同时在两种种质中产生多态性条带。利用苦荞全基因组序列可实现SSR标记的批量开发,可鉴定出适用于苦荞和甜荞遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定等研究的SSR引物。     

山西北部地区引种苦荞品种的灰色关联度分析

应用灰色关联度法对晋北地区引种的12个苦荞品种的主要农艺性状进行分析与综合评价。结果表明：引种的苦荞品种中综合生产性能表现较好的是晋荞5号、冼马选1号、KQ-1-6、西农9909和云苦5号;各农艺性状的权重顺序为生育期>主茎分枝数>株高>主茎节数>千粒重>产量,结果可为晋北地区苦荞引种和推广提供科学依据。     

苦荞种质资源表型性状的遗传多样性分析

为了解苦荞产量与农艺性状之间的关系,以26个苦荞种质资源为材料进行主要表型性状与产量的统计分析。结果表明：26个苦荞种质资源存在丰富的遗传变异,不同性状之间变异系数差异较大,变异系数最大的是主茎分枝数,为33.30%,变异系数最小的是生育日数,为6.13%。相关性分析表明,苦荞各性状之间存在不同程度的相关性,且大多数性状与产量呈正相关关系。主成分分析提取了前3个主成分,其累计贡献率达到89.55%。聚类分析将26个苦荞种质资源分为3类,第Ⅰ类综合性状不突出,第Ⅱ类属于高产型,第Ⅲ类属于矮秆型。     

外源硒对苦荞生长发育及子粒硒含量的影响

为了研究外源硒对苦荞生长发育及子粒硒含量的影响,在开花期对大田苦荞喷施不同浓度亚硒酸钠（0、2.5、5.0、10.0和20.0mg/L）,分析在喷硒后5、10、15和35d地上部干生物量和鲜生物量、叶面积指数、叶绿素含量、产量及子粒硒含量的变化。结果表明：（1）在Se1（2.5mg/L）水平下外源硒能够显著提高苦荞地上部干和鲜生物量、叶面积指数、叶绿素含量;（2）在Se2（5.0mg/L）水平下能够显著提高苦荞产量,与对照相比,增幅为13.49%;（3）施硒可以显著提高苦荞子粒硒含量,子粒硒含量随喷施硒浓度的增加而增加,增幅为0.8%~4.2%。综上,适量外源硒能够促进苦荞生长发育,提高产量及子粒硒含量。     

苦荞粒形相关性状的遗传分析

利用籽粒大小差异较大的2个苦荞品种的杂交后代开展了与产量具有密切关系的粒形相关性状的遗传规律及其性状间的相关性分析。结果表明,F₂和F₃群体的粒长、粒宽、长宽比和千粒重表现值范围都超过亲本的表现值,并且粒长、粒宽和长宽比的变异系数均小于10%,千粒重的变异系数大于10%。另外,粒长、粒宽、长宽比和千粒重的加性方差均大于显性方差,广义遗传率在F₂和F₃代中分别为0.77~0.82和0.82~0.85,固定遗传率都达到0.80以上。粒形性状间的相关性分析结果表明,粒长、粒宽和千粒重相互间都存在极显著的正相关,粒宽和千粒重,粒长和长宽比的遗传相关系数较大。以上结果表明,具有较高遗传率的粒形相关性状可以在后代早期进行选择,但由于这些性状是数量性状而且受多个基因的控制,因此建议继续繁殖后代到基因型稳定,同时考虑性状间的相关性选拔最为有效。