进境澳大利亚大麦上葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

自进境澳大利亚大麦样品上,采用常规平板分离法获得1株疑似葡萄茎枯病菌菌株74919。通过形态学特征观察、β-tubulin和actin序列比对分析以及致病性测定,对该菌株进行了种类鉴定。结果表明:菌株74919在PDA培养基上生长良好,可产生大量分生孢子器和厚垣孢子;基于β-tubulin和actin序列构建的系统发育树中,菌株74919和其他葡萄茎枯病菌相关序列划分在同一分支;菌株74919接种大麦叶片,在接种部位引起叶斑症状。根据上述实验结果,将菌株74919鉴定为葡萄茎枯病菌(Didymella glomerata),这是我国口岸首次从进境澳大利亚大麦中截获葡萄茎枯病菌。     

台湾省苹果上牛眼果腐病菌的截获鉴定

为明确从宁波空港口岸入境旅客携带苹果上截获的1株明孢盘菌属菌株60017的分类地位,通过形态学特征观察、内转录间隔区(ITS)和β-微管蛋白基因(β-tubulin)序列比对分析以及致病性测定,对该菌株进行了种类鉴定。结果表明:菌株60017在PDA培养基上的菌落为圆形,边缘整齐,呈乳白色,气生菌丝较少,可产生大量分生孢子;基于ITS和β-tubulin序列构建的系统发育树中,菌株60017和苹果牛眼果腐病菌Neofabraea kienholzii处于同一分支;菌株60017接种苹果后,在接种部位能引起褐腐症状,与原发病症状一致。结合形态学特征、致病性测定结果以及分子鉴定结果,最终将该菌株鉴定为苹果牛眼果腐病菌N. kienholzii。     

进境高粱种子中葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

从进境的美国高粱样品中分离到一株与葡萄茎枯病菌Didymella glomerata相似的菌株4358-17。其菌落形态和显微特征均与葡萄茎枯病菌一致。多个位点(LSU、ITS、TUB2、ACT)序列比对显示菌株4358-17与GenBank登录号为KT389718、FJ427004、FJ427115、FJ426896的葡萄茎枯病菌相似性均达到100%。系统发育分析结果表明菌株4358-17与葡萄茎枯病菌株聚集在同一个分支上,支持率为99%。菌株4358-17接种高粱和小麦叶片,4d后接种部位出现明显症状。根据上述试验结果,将进境美国高粱样品中分离的菌株4358-17鉴定为葡萄茎枯病菌。     

进境苹果果实中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定

对来自美国的苹果进行了病原菌分离,结果在果实中分离到1株疑似苹果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968。对其进行了病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测,实验结果表明,菌株Nk-2968在PDA培养基上生长良好,能产生大量的分生孢子;经真菌通用引物(ITS4/ITS5)及β-tubulin引物(Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo)分别扩增和测序,菌株Nk-2968与Gen Bank中登录号AF281462.1、HG793110.1和HG793112.1的菌株序列同源性达到100%;病菌接种苹果8 d后开始发病。根据上述实验结果,将分离获得的菌株Nk-2968鉴定为苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea kienholzii)。这是我国口岸首次在进境的苹果果实上截获该危险性有害生物。     

基于TaqMan MGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光PCR检测方法

 葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L^-1,探针终浓度为0.6 μmol·L^-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。     

基于TaqMan MGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光PCR检测方法

 葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L^-1,探针终浓度为0.6 μmol·L^-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。     

辽宁梨树枝枯病病原菌Diplodia seriata的分离与鉴定

在辽宁兴城秋子梨栽培园出现一种新型枝干病害,主要症状为枝枯及木质部坏死。为明确梨树枝枯病病原菌的分类地位,本研究从辽宁兴城地区采样,经过菌株分离培养和致病性测定,以及形态学鉴定结合病原菌的ITS、EF-1α和β-tubulin多基因联合构建系统发育树,确定引起秋子梨枝枯病的病原菌为色二孢Diplodia seriata。研究结果为明确色二孢引起的辽宁梨树枝枯病发生规律和防治措施的制定提供了理论基础。     

美国苜蓿草中鳞球茎茎线虫的鉴定

2015年,宁波口岸从美国苜蓿草中分离到一种茎属线虫,通过形态学和分子生物学方法,鉴定为鳞球茎茎线虫,这是我国口岸首次从牧草中截获该线虫。部分茎属线虫的核糖体28S和ITS基因DNA序列分析表明,28S基因是茎属线虫合适的DNA条形码基因。     

南疆骏枣黑斑病症状表现及病原菌鉴定

为明确南疆骏枣黑斑病的症状表现及病原菌种类,2013—2014年在新疆建设兵团第一师选取具有代表性的5个骏枣园,对枣叶、花、果等组织上黑斑病的症状进行了系统调查,采用组织分离法和回接试验分离病原菌及测定其致病性,并根据病菌形态特征、ITS序列和β-tubulin序列分析对病原菌进行了鉴定。结果表明:枣叶、花和果均可感染黑斑病菌,室内接种和田间骏枣黑斑病症状相同,叶、花和果中的病原菌可以相互侵染,并在枣果上均表现出黑斑病典型症状;不同发病组织中分离纯化得到357株菌株,形态观察表明,侵染叶、花和果的菌株均为链格孢属链格孢菌Alternaria alternata(Fr.)Keissler;通过ITS序列和β-tubulin序列分析,并结合形态学特征进一步确定引起骏枣不同组织的黑斑病病原菌为链格孢菌A.alternata。     

进境美国大豆上Diaporthe ueckerae的检测鉴定

挑选美国进境的黄大豆中变色、皱缩和腐烂等症状的病籽粒进行分离培养，获得1株纯化的间座壳属真菌Duc-0530，该菌株菌落初期白色平铺，气生菌丝少，培养后期背面中央呈黑褐色。病菌α型分生孢子无色透明、光滑、纺锤形至椭圆形，无隔膜，有2个油球，大小为（5～5.8）～(6.5～7.5)μm×（2～2.3）～3.0μm（平均5.86μm×2.54μm）。利用真菌5个基因片段（ITS、β-tubulin、EF-1α、HIS和CAL）的通用引物对菌株Duc-0530进行PCR扩增和序列分析，发现该菌株的5个基因的序列与GenBank中Diaporthe ueckerae的同源性高，达到98%～100%。系统发育分析结果显示菌株Duc-0530与D. ueckerae以自展支持率100%聚集在同一分支。该菌株接种大豆和甜瓜出现茎基部位溃疡，叶片呈变褐皱缩症状。根据上述检测结果，将菌株Duc-0530鉴定为D. ueckerae。该病菌是国际上大豆生产中新发危险性病菌，为我国口岸在美国大豆中的首次截获报道。     

进境美国大豆夹杂向日葵黑茎病菌的检疫鉴定

正大豆是一种重要的粮食作物和食用油原料,国内的市场需求量日益增长,目前我国已成为大豆净进口国。进口大豆虽能满足国内市场需求,但加大了外来有害生物传入的风险。向日葵黑茎病是一种毁灭性的向日葵病害,其病原菌向日葵黑茎病菌Plenodomus lindquistii属于我国进境检疫性植物病原真菌(段维军等,2015;2017)。2017年12月,宁波口岸自进境美国大豆夹杂的向日葵种子上分离获得1株菌株72298-10,为明确其分类地位,本研究通过形态学观察、ITS序列分析和致病性测定对其进行鉴定,以期为口岸疫情检测、防控和后续处理等工作提供参考。     

黑龙江和云南葡萄产区灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性检测

为明确黑龙江省和云南省葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性频率,从两省分别采集、分离到葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea 39株和38株,利用菌丝生长速率法测定其对多菌灵和异菌脲的敏感性,并分别检测上述菌株两种药剂靶标基因β-tubulin和Bos1的突变情况.结果表明,黑龙江省葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗...     

番茄茎腐病菌的分子鉴定及致病力检测

本研究采用形态学观察、核糖体DNA转录间隔区(ITS)克隆、系统发育树和致病力检测等方法对河南周口地区番茄茎腐病菌进行分子鉴定和致病力检测,以期为茎腐病的抗病育种及病害防治提供一定的理论依据。形态学观察结果显示,从周口地区番茄上分离的茎腐病病原菌属于镰孢属,ITS序列分析及系统进化树分析进一步确定其为茄镰孢,分离物与茄镰孢福建分离物(JN232141.1)亲缘关系最近,聚在一个进化支上,致病力检测结果表明在测试的植物中该病菌对茄科植物龙葵的致病力最强,该病菌寄主范围广,可侵染茄科、十字花科多种植物。     

西瓜蔓枯病分子诊断技术研究

 本文测定西瓜上的西瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)及西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)的rDNA的ITS序列,比对近缘种及西瓜上不同病菌的ITS序列同源性,设计出特异性上游引物XM-2和下游引物XM-R2。经过对XM-2/XM-R2引物的PCR扩增条件的优化,可以扩增出一条344bp的西瓜蔓枯病菌特异性DNA条带。上述方法可以检测到pg以上的蔓枯病菌基因组DNA,并且可以准确扩增出西瓜蔓枯病自然病样中特异性的DNA片段。本文建立了一项西瓜蔓枯病分子检测技术,该方法准确、快速、可靠,可用于西瓜蔓枯病田间的快速诊断。     

广西地区葡萄黑痘病病原菌的分离与鉴定

采用常规组织分离法对广西南宁、河池两地的葡萄黑痘病菌进行分离、纯化,分别得到37和31株分离菌。经菌落形态观察及r DNA ITS序列分析,南宁37株分离菌为同一菌株,河池31株分离菌为同一菌株,以NN和HC分别代表两地菌株,对它们进行形态学、致病性鉴定及r DNA ITS区域序列分析。结果显示,两地菌株形态学与致病性存在较大差异,但都符合黑痘病菌生长形态。NN菌落为红棕色、近圆形,边缘光滑。菌落中心位置丘状凸起,表面有白色菌丝和透明粘稠的小液滴,周围边缘有较规则的褶皱。HC菌落呈浅橙色、近圆形,边缘光滑。菌落中心位置丘状凸起,表面有少量白色菌丝,无液滴,周围边缘有不规则褶皱隆起。人工接种葡萄后均能引起典型的黑痘病症状,NN致病性强于HC。使用r DNA ITS区域通用引物ITS1F/ITS4进行PCR扩增后,NN和HC分别得到1 124 bp和818 bp的片段。比对结果显示1 124 bp与Elsinoe ampelina(AY826763.1)序列覆盖率达92%,序列一致性达99%;818 bp与Elsinoe ampelina(AY826762.1)序列覆盖率达75%,序列一致性达99%。因此,NN和HC均是引起广西葡萄黑痘病的病原菌。     

周口地区油菜白粉病病原的鉴定

本研究通过扫描电镜观察以及分子鉴定方法,对引起河南周口地区油菜白粉病的病原进行了鉴定。结果显示:在扫描电镜下该病原菌分生孢子为椭圆或圆柱形;采用真菌核糖体DNA转录间隔区(ITS)通用引物,扩增病菌核糖体基因ITS区,并对产物进行克隆、测序及进化树分析,其ITS序列与Erysiphe cruciferarum(韩国)的ITS序列同源性为100%,而聚在一个进化枝上。上述结果表明,周口地区油菜白粉病菌属于E.cruciferarum,与韩国甘蓝型油菜白粉病菌亲缘关系最近。     

进境澳大利亚大麦夹杂油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定

采用常规平板分离法,从进境澳大利亚大麦中夹杂的油菜籽上获得1株疑似油菜茎基溃疡病菌的菌株01829.通过致病性测定、形态学观察、特异性引物扩增、ITS序列比对分析,对01829进行了种类鉴定.结果表明:菌株01829在PDA培养基上生长较慢,菌落边缘不整齐,产生大量分生孢子器和分生孢子;采用特异性引物对LMR1-D和L...     

检疫性疫霉DNA条形码筛选

 疫霉是世界关注的一类植物病原真菌。以疫霉属80个种122个菌株为研究材料,以ITS、CO1、EF-1α和β-tubulin 4个基因片段为候选DNA条形码,分析表明ITS、CO1基因的PCR扩增和测序成功率最高,分别为100%和96.7%;ITS、CO1和β-tubulin存在明显的条码间隔,但种间、种内距离频率分布存在较小重叠;种间、种内遗传距离Wilcoxon秩和检验结果认为各基因对种内遗传距离的效力相等,对种间遗传距离的区分能力为ITS>CO1>β-tubulin。CO1基因和ITS片段可同时作为11种检疫性疫霉的首选DNA条形码,β-tubulin基因可作为辅助DNA条形码。     

猕猴桃果腐病菌PCR和实时荧光PCR检测

为了快速、准确地鉴定猕猴桃果腐病菌(Neofabraea actinidiae),根据GenBank中N. actinidiae的β-tubulin序列设计特异引物NAC-F/R和探针NAC-P,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物NAC-F/R扩增供试的4株N. actinidiae能得到389 bp的预期目标条带,但扩增其他20个非N. actinidiae供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为140 pg菌丝体DNA;探针NAC-P对供试4株N. actinidiae表现为阳性扩增,而对其他菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达14 pg菌丝体DNA,比常规PCR高10倍。样品检测试验结果表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确地检测猕猴桃果腐病菌。     

基于DNA条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定

为筛选合适的基因序列对镰刀菌属Fusarium真菌进行检测鉴定,以从不同寄主分离获得的11种57株镰刀菌为材料,选择nr DNA-ITS、EF-1α、mt SSU和β-tubulin作为候选基因,将序列获得的难易程度和种内与种间遗传距离频率分布作为评价指标,对测序获得的有效序列进行研究,筛选出该属的DNA条形码。结果表明:EF-1α基因具有较高的PCR扩增与测序成功率,为98.2%,较mt SSU和β-tubulin基因更容易获得序列片段;且种内与种间遗传距离重叠部分较少,除木贼镰刀菌F.equiseti种内遗传距离为0.029,大于黄色镰刀菌F.culmorum和禾谷镰刀菌F.graminearum种间遗传距离0.021外,种间差异明显大于种内差异,优于其它基因,能更好地区分镰刀菌;利用EF-1α基因序列构建的系统发育树显示,相同种聚集在同一分支,不同种划分在不同分支,鉴别能力较好;EF-1α基因不能扩增出其它6株非镰刀菌属的主要植物病原真菌,而对镰刀菌的PCR扩增效果很好,电泳检测结果条带单一、明亮。表明EF-1α基因可作为镰刀菌属鉴定的DNA条形码。