新型鸭呼肠孤病毒病浓缩灭活疫苗的制备及免疫原性分析

为研制高效的新型鸭呼肠孤病毒病(NDRV)灭活疫苗,分别采用病毒尿囊液和浓缩后病毒尿囊液为抗原,经甲醛灭活处理后与常规油佐剂制成灭活疫苗,并进行种鸭免疫后血清学检测、雏鸭免疫保护及安全试验。结果表明,浓缩疫苗安全性好,能明显提高疫苗的免疫效果,高峰期抗体效价的免疫持续期比常规疫苗长;浓缩疫苗免疫雏鸭后的免疫保护性达100%。以上研究表明,NDRV浓缩疫苗安全、高效,在雏鸭上具有良好的免疫保护效果,具有良好的市场前景。     

HP—PRRS纯化灭活疫苗免疫效力研究

为提高目前高致病性蓝耳病（HR—PRRS）灭活疫苗的免疫效果，将经Marc-145细胞培养收获的HP-PRRS病毒原液超滤浓缩50倍，再经灭活后用Sephamse 4 Fast Flow分子筛柱层析，收集完整的病毒粒子，加油佐剂制成纯化HP—PRRS灭活疫苗。纯化后疫苗的攻毒保护率达到415以上，血清抗体检测阳转率达86％以上，均高于同批病毒液制成的未纯化灭活疫苗，且差异显著。试验证明，HR—PRRS病毒液经浓缩纯化制成疫苗后，增强了免疫效果。     

高致病性PRRSV浓缩灭活疫苗的研制及免疫效果

[目的]研制高致病性PRRSV浓缩灭活疫苗。[方法]分别以病毒液、病毒浓缩液作为抗原,以甲醛、β-丙内酯为灭活剂,制成A、B、C、D 4种灭活疫苗,进行物理性状和无菌检验,安全检验合格后,与商品疫苗E进行免疫效果比较。[结果]4种疫苗均有良好的安全性。免疫后35 d,未浓缩抗原的A、C疫苗及商品疫苗E组抗体均未阳转,浓缩抗原的B、D疫苗组抗体阳转率分别达到80%和100%。[结论]浓缩病毒液制成的灭活疫苗比未浓缩病毒液制成的灭活疫苗及商品疫苗具有较好的免疫效果。     

MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强效应

【目的】探讨单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)对口蹄疫(food and mouth disease,FMD)O型灭活疫苗的免疫增强效应,提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果.【方法】通过检测MPLA刺激脾脏细胞的增殖情况和刺激DC后成熟及吞噬能力的大小,对MPLA的体外免疫刺激效应进行评价;将MPLA与ISA 206和灭活FMDVO型抗原配制疫苗后免疫小鼠,通过检测抗体水平、T细胞亚群、抗原特异性淋巴细胞增殖及浆细胞的比例,评价MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强作用.【结果】MPLA体外可刺激B淋巴细胞增殖,上调DC表面共刺激分子的表达,使其吞噬能力减弱;制备疫苗免疫小鼠,血清抗体水平检测发现,MPLA组在7、14 d时抗体水平显著高于ISA 206组,且其抗原特异性的B淋巴细胞增殖,外周血中CD19~+CD27~+CD38~+浆细胞的比例也显著高于ISA 206组.【结论】MPLA通过促进B淋巴细胞的增殖与活化增加了抗体的产生,增强了小鼠对口蹄疫疫苗的免疫应答能力,证实MPLA是口蹄疫疫苗的良好候选免疫佐剂.     

高效液相体积排阻色谱法测定口蹄疫灭活疫苗146S 抗原含量及疫苗质量评估

【背景】 口蹄疫疫苗质量评价方法对疫苗生产企业和监管部门进行质量控制尤为重要,146S抗原含量是评价口蹄疫疫苗质量的关键指标。蔗糖密度梯度离心法（sucrose density gradient centrifugation,SDGC）是公认经典的测定口蹄疫146S抗原含量的方法,但存在检测耗时长、过程复杂、重复性差等缺点,影响了疫苗的质量监测。口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量高效液相体积排阻色谱法（size-exclusion high-performance liquid chromatography, SE-HPLC）是一种简便、快速、自动化程度高、高效的测定方法。【目的】 在初步建立的采用SE-HPLC测定口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量方法的基础上,针对不同类型、不同浓缩纯化生产工艺制备的口蹄疫灭活疫苗,进一步确认SE-HPLC法在检测过程中的普适性势在必行。【方法】 利用口蹄疫146S抗原标准品建立SE-HPLC法标准曲线,求得回归方程,用于检测样品的146S含量。采用SE-HPLC法和SDGC法分别检测146S抗原标准品1倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀释的5个样品和市场上随机选取的22批疫苗, 计算146S抗原含量,对比分析两种方法的相关性。用SE-HPLC法,3次重复检测不同企业生产的134批口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量,通过色谱图特异性、检测值相对标准偏差（relative standard deviation ,RSD）分析SE-HPLC法的重复性,评价该方法的适用性,分析市场流通疫苗的总体质量情况。【结果】 SE-HPLC法建立的标准曲线,峰面积与146S抗原含量的线性关系良好（R ²=0.9981,n=8）。口蹄疫146S抗原标准品5个稀释样品和22批口蹄疫疫苗的146S抗原含量检测结果表明,口蹄疫146S抗原含量检测SDGC法和SE-HPLC法高度正相关（R_S ²=0.9994,n_S=5;R_v ²= 0.9602,n_v=22）。134批口蹄疫灭活疫苗中,146S抗原含量相对标准偏差RSD＜5%的疫苗批次分别占疫苗总批次（134批）、单价苗总批次（18批）、双组分及双价苗总批次（76批）、三价苗总批次（40批）的81.34%、72.22%、85.53%、80.00%;146S抗原含量相对标准偏差RSD≤10%的疫苗批次占疫苗总批次（134批）的97.76%。口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法检测重复性良好,其中疫苗146S抗原含量2—4μg·mL ^-1时,检测重复性最好。所有批次疫苗均检测到目的峰,目的峰的平均起峰、最高峰、落峰时间分别为SE-HPLC法进样后的11.58、12.90、14.93min,平均持续3.36min。134批口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量为1.11—80.36μg·mL ^-1,其中单价苗、双价苗、双组分苗、三价苗146S抗原含量均值分别为2.07、2.40、2.85、13.14 μg·mL ^-1。【结论】 口蹄疫灭活疫苗146S 抗原含量SE-HPLC法适用性好、重复性高、高效、快速、简便,能够用于检测不同类型的口蹄疫灭活疫苗,从而进行疫苗的质量监测和评估。市场流通的口蹄疫灭活疫苗146S含量较高,疫苗质量较好。     

牛AsiaI 型口蹄疫克隆纯化疫苗的免疫效果检验

对牛AsiaI口蹄疫克隆纯化疫苗的物理性状和无菌进行检验;采用豚鼠和小白鼠进行安全检验;并应用该疫苗在黄牛体内进行免疫效力检测.结果表明,应用克隆毒株研制的油乳剂灭活疫苗为乳白色,稳定、稀薄、无菌、安全而且在免疫效力方面克隆口蹄疫AsiaI_AKTO3毒株疫苗的PD50比普通疫苗提高2.4倍.     

高致病性蓝耳病纯化灭活疫苗的研制(英文)

[目的]改进和提高现行高致病性蓝耳病(HR-PRRS)灭活疫苗的纯度和效价。[方法]该研究将经Marc-145细胞培养收获的HP-PRRS病毒原液超滤浓缩50倍,灭活后用Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱层析,收集完整的病毒粒子,加油佐剂制成纯化HP-PRRS灭活疫苗。[结果]通过纯化可将HP-PRRS病毒与非病毒蛋白分开,纯化后测定病毒蛋白含量收率为76.7%~82.4%,杂蛋白含量去除率均为96%以上,且纯化疫苗的攻毒保护率达到4/5以上,血清抗体检测阳转率达86%以上,均高于未纯化灭活疫苗,差异显著。[结论]HR-PRRS病毒液经浓缩纯化制成疫苗后,增强了免疫效果,并可有效地去除杂蛋白,避免了疫苗的过敏反应和应激反应。     

正向间接血凝试验监测家畜O型口蹄疫抗体

有效控制口蹄疫关键在于早期监测,准确监测是防制口蹄疫的重要环节。特对某地方乡镇散养、规模化养殖场采取牛、羊、猪的血清,利用正向间接血凝试验对家畜O型口蹄疫疫苗免疫抗体进行监测,了解家畜免疫效果。监测结果显示,该地方牛羊的口蹄疫疫苗免疫合格率平均为76%,猪的口蹄疫疫苗免疫合格率平均为60%;规模化养殖场较个体散养户免疫抗体效果好;牛口蹄疫O型灭活苗的免疫抗体效果好于牛口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活疫苗的免疫抗体效果。     

GEM技术浓缩纯化O型口蹄疫病毒灭活抗原方法的建立

[目的]验证利用革兰氏阳性增强基质颗粒(GEM)浓缩纯化口蹄疫病毒(FMDV)抗原的可行性。[方法]将含有3个自溶素基序的锚钩蛋白基因(PA)与针对O型口蹄疫病毒特异性纳米抗体基因(VHH)串联克隆入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-VPA,将其转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),表达获得融合重组蛋白VPA。先将GEM颗粒与重组蛋白VPA在37℃孵育30 min,离心,取沉淀用适量的FMDV抗原液重悬,再经一步低速离心,获得沉淀即为浓缩纯化的口蹄疫病毒抗原。利用SDS-PAGE、Western-blot、蛋白含量测定及146S测定等方法对浓缩纯化方法的可行性进行鉴定,并通过动物免疫试验初步验证浓缩纯化后抗原的免疫原性。[结果]VPA融合蛋白能够在大肠杆菌中部分可溶性表达。作为接头蛋白,VPA既能与GEM颗粒结合,又能与FMDV抗原结合。SDS-PAGE与Western-blot结果表明:FMDV通过GEM法得到有效纯化;146S测定结果表明FMDV的回收效率达到99%;总蛋白含量测定结果显示口蹄疫抗原杂蛋白去除率达到90%;动物免疫试验结果显示GEM技术纯化后的FMDV具有良好的免疫原性。[结论]利用GEM技术浓缩纯化口蹄疫病毒抗原是可行的。     

牛AsiaⅠ型口蹄疫克隆纯化疫苗的免疫效果检验

对牛AsiaⅠ口蹄疫克隆纯化疫苗的物理性状和无茵进行检验;采用豚鼠和小白鼠进行安全检验;并应用该疫苗在黄牛体内进行免疫效力检测。结果表明,应用克隆毒株研制的油乳剂灭活疫苗为乳白色。稳定、稀薄、无茵、安全而且在免疫效力方面克隆口蹄疫AsiaⅠ_AKT03毒株疫苗的PD50比普通疫苗提高2．4倍。     

猪O型口蹄疫疫苗免疫抗体消长动态研究

[目的]掌握猪O型口蹄疫疫苗免疫后的抗体消长规律.[方法]应用猪O型口蹄疫灭活疫苗1、灭活疫苗2和合成肽疫苗对198头试验猪进行至少2次免疫,定期采血后用液相阻断ELISA检测方法测定免疫前后抗体效价.[结果]在首次免疫时,疫苗免疫效果受母源抗体的干扰较大;仔猪首免后抗体很难达到完全保护(大于61og2)水平,应适当缩短首免与二免的间隔时间,尽量减少免疫空白期;合成肽疫苗的首免效果较灭活疫苗好,首次免疫推荐使用合成肽疫苗;如果生猪饲养周期过长,免疫2次的生猪出栏时抗体不能达到完全保护水平;规模场试验猪的母源抗体水平低于散养户,随着试验猪日龄的增加和免疫的加强,规模场试验猪的免疫抗体滴度逐渐高于散养户.[结论]该研究可为研究猪O型口蹄疫抗体变化和制定猪O型口蹄疫疫苗的免疫程序提供参考和借鉴.     

鸡毒支原体灭活抗原超滤浓缩工艺的研究

[目的]建立一套适合生产鸡毒支原体灭活疫苗的抗原浓缩工艺。[方法]采用Millipore中型盒式超滤系统对鸡毒支原体灭活抗原进行超滤浓缩试验,并利用紫外光度法测定不同倍数浓缩滤液的吸光度变化。[结果]消毒液高压灭菌后无细菌污染,超滤仪回流液循环后、抗原浓缩前后均无细菌污染。瑞氏染色后发现,除尾液样品中无支原体外,其他样品中均可见形态不规则、蓝色的支原体菌体。使用100K超滤膜堆浓缩后,支原体抗原无泄漏。溶液的吸光度随着浓缩倍数的增加而上升。原液浓缩5、10、15倍后,吸光度分别增加了0．718、1.2815和1．4645。[结论]此次试验建立了适合于鸡毒支原体抗原超滤浓缩的生产工艺流程,为鸡毒支原体疫苗及其多联疫苗的研制奠定了基础。     

猪O型口蹄疫O/MYA98/BY/2010株灭活苗与合成肽苗免疫效果对比研究

通过监测湖南省娄底市娄星区4年的猪O型口蹄疫疫苗免疫抗体效果,对猪O型口蹄疫O/MYA98/BY/2010株灭活疫苗与猪O型口蹄疫合成肽疫苗在临床应用中的免疫效果进行比较性研究。结果表明:4年的猪O型口蹄疫疫苗抗体免疫合格率差异显著(p0.05),2014年使用O/MYA98/BY/2010株口蹄疫灭活苗免疫合格率最高,为89.3%;除2013年外,其余3年的疫苗免疫合格率均达到国家农业部规定的70%的要求;相应猪O型口蹄疫疫苗当年在不同养殖场中的免疫效果表现均有一定的差异,但各年的变异系数间差异不显著(P0.05),两种类型的疫苗在连续使用后出现不同程度的效力减退现象。     

多型口蹄疫疫苗灭活时间和纯化的比较研究

【目的】为了探讨不同灭活时间及纯化对多型口蹄疫疫苗146 S、总蛋白量、抗原收获量及疫苗效力的影响。【方法】选取OM/Re-A/AF/Asia1 4种不同型的口蹄疫疫苗为研究对象,设定不同灭活时间(8、10、12、14和16 h),对每个时间点疫苗母液中146 S、总蛋白和抗原收获量进行检测和差异性分析;测量纯化前后146 S和总蛋白的变化趋势;测定不同灭活时间及纯化前后疫苗PD50数值进行判定效力。【结果】灭活不同时间点,146 S含量和抗原收获量随着时间先增高后平缓的趋势,146 S在14 h出现平缓,而抗原收获量在10 h时开始平缓;146 S含量OM和AF型明显高于Re-A和Asia1型,抗原收获量Asia1型最高;总蛋白含量随着时间呈现先降低后平缓的趋势,AF型口蹄疫疫苗降低最明显;疫苗纯化前后相比分析发现,146 S含量明显升高,总蛋白含量明显降低(P0.01)。4种疫苗PD50值随着纯化时间先增大后平稳,纯化后PD50显著提高(P0.01),免疫效力增强。【结论】OM/Re-A/AF/Asia1 4种不同型的口蹄疫疫苗在纯化不同时间点,疫苗中146 S、抗原收获量和总蛋白含量呈规律性变化,且纯化前后146 S、总蛋白含量及PD50值差异性极显著,表明口蹄疫疫苗的灭活时间和纯化是影响疫苗效价的重要因素。     

羊场疫苗联合免疫程序初探

为了简化免疫程序,提高工作效率,降低劳动成本,将4种不同疫苗组合联合免疫陕北白绒山羊,单独免疫组作对照。免疫接种后,观测疫苗联合使用的安全性,同时采用商品化试剂盒检测免疫后不同时间的抗体水平。结果显示,联合免疫组中所有试验羊在免疫后7 d观察期内,均未观察到任何不良反应,不论是2种疫苗联合免疫组(口蹄疫灭活疫苗和羊快疫-猝狙-羔羊痢疾-肠毒血症四联干粉灭活疫苗与山羊痘活疫苗和山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗)、4种疫苗联合免疫组(口蹄疫灭活疫苗、羊快疫-猝狙-羔羊痢疾-肠毒血症四联干粉灭活疫苗、山羊痘活疫苗和山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗)还是5种疫苗联合免疫组(口蹄疫灭活疫苗、小反刍兽疫活疫苗、羊快疫-猝狙-羔羊痢疾-肠毒血症四联干粉灭活疫苗、山羊痘活疫苗和山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗),组内每种疫苗免疫后不同时间抗体水平在检测期内与单独免疫每种疫苗的对照组所产生的抗体水平无显著差异,同时联合免疫组内每种疫苗之间未发现互相干扰现象。因此,联合免疫是安全有效的,结果可为羊场免疫程序的优化提供参考。     

猪O型口蹄疫灭活疫苗免疫效果评估

为了考察市售高效灭活疫苗与政府采购疫苗免疫效果之间差异分别选取了两家疫苗公司生产的政府采购疫苗和高效灭活疫苗,分别在4个猪场展开免疫效果评估。4个猪场按照相同的免疫程序进行免疫,分别采集免疫前、加强免疫后30 d、加强免疫后60 d的血清,用O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA试剂盒进行抗体检测。结果表明,加强免疫后30 d,抗体平均效价依次为1∶196.9、1∶251.9、1∶256.0、1∶243.8。高效灭活苗与政府采购疫苗在同样的免疫程序和免疫剂量下,同一时间点其抗体水平效价差异不显著;但免疫副反应方面,高效灭活疫苗比政府采购疫苗低,且差异极显著。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备及检验

[目的]制备鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感[ND-IB-AI（H9亚型）]三联灭活疫苗。[方法]以NDV La Sota株、IBVM41株、AIV（H9亚型）WD株为毒种,分别接种鸡胚,制备NDV、IBV及AIV（H9亚型）抗原液;采用病毒超滤系统浓缩病毒抗原液,并用甲醛溶液进行灭活;将浓缩灭活后的3种抗原液按一定比例混合（1∶1∶1）,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗;对制备的疫苗进行无菌检验和物理性状观察。[结果]共制备了3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗实验室制品,经无菌检验为阴性,外观为乳白色,剂型为油包水型（W/O型）,粘度6.36.8 s,离心和37℃放置21 d均不分层。[结论]所制备3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗均无细菌污染,其物理性状均能达标。     

鸡新城疫灭活疫苗免疫佐剂的研究

佐剂与抗原混合后注射动物体内,能非特异性改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用。凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均可称为佐剂。目前新城疫灭活疫苗的佐剂免疫增强效果不理想,亟待开发一种适用于鸡新城疫灭活疫苗的免疫佐剂。试验对鸡新城疫灭活疫苗免疫佐剂进行研究,结果表明,佐剂溶液中含有左旋咪唑2~10 mg·mL~(-1)的用量配比效果最优,且用此佐剂制成的鸡新城疫灭活疫苗,疫苗免疫效果明显提高。     

乌鲁木齐地区牛口蹄疫O型Asia-Ⅰ型双价灭活疫苗免疫效果的检测与分析

[目的]研究乌鲁木齐地区牛口蹄疫O型Asia-Ⅰ型双价灭活疫苗的免疫效果.[方法]应用液相阻断ELISA法检测492份口蹄疫O型Asia-Ⅰ型双价灭活疫苗的免疫效果.[结果]免疫牛群对牛口蹄疫O型的平均免疫合格率为97.6％,对Asia-Ⅰ型的平均免疫合格率为97.7％.[结论]牛口蹄疫O型Asia-Ⅰ型双价灭活疫苗可以使免疫牛产生有效的免疫保护.     

口蹄疫抗体免疫层析试纸的临床应用及性能评价

为评价前期研制的猪口蹄疫O型抗体检测试纸的临床应用效果,检测了162头份口蹄疫病毒(FMDV)多肽疫苗免疫猪血清和87头份灭活疫苗免疫猪血清,并与UBI FMDV抗体检测ELISA和美国BioXL FMDV抗体检测ELISA做平行对比试验。结果显示,试纸与2种ELISA方法的符合率分别为95.06%和96.55%。说明该试纸可以用于猪FMDV O型抗体的临床检测,为评价口蹄疫疫苗免疫效果提供了快速、简便的方法。