PRRSV经典株和变异株RT-nPCR鉴别诊断方法的建立

【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测,达到快速诊断的目的。【方法】根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列,设计并合成了2对引物,通过改变不同的反应体系和反应条件,建立PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测,验证建立RT-nPCR方法的适用性。【结果】建立了PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,该方法检测的cDNA含量极限为1.3×10-7 pg/μL;且仅能从PRRSV毒株中扩增到目的条带,从CH-1R经典株扩增出649bp条带,从SXXY/2013变异株扩增出562bp条带,电泳后能清晰区别,而从其他参考毒株中均不能扩增出目的条带。从48份疑似病料组织和血清中能直接检测出31份阳性结果。【结论】建立了一种灵敏度高、特异性好、可直接从病料组织和血清中快速鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332bp（经典株）和241bp（变异株）,根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332 bp（经典株）和241 bp（变异株）,根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100 fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和高致病株双重RT-PCR检测方法的建立

[目的]建立具有高敏感性能区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和高致病株的双重RT-PCR检测方法.[方法]首先从退火温度与引物浓度先对猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病株的单项RT-PCR方法的条件分别进行筛选与优化,然后对其双重RT-PCR方法的条件进行筛选与优化,并进行特异性与敏感性检测,最后初步应用于临床样品检测.[结果]建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和高致病株双重RT-PCR检测方法不能检出猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒等当前流行较广的其他猪源RNA病毒,对猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病株的检测灵敏度分别是100、200copies/μL.此方法对2020-2021年8个猪场的220份血清样品的检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病株的个体阳性率分别为7.73％和43.64％,与单项RT-PCR方法检测结果完全一致.[结论]建立了一种高敏感性的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和高致病株双重RT-PCR检测方法.     

PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法的建立与应用

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的nsp2基因序列,在nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物,在小缺失区设计1条上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通株的扩增,建立了PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法。建立的RT-PCR方法用于临床病料的检测,部分阳性结果测序,变异株序列与报道的序列同源性在97%以上。结果表明,该方法特异、快速、简便,可以用于PRRSV变异株和普通株的鉴别。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物.分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PER条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PER诊断方法.应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株.试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PER诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据.     

CSFV和PRRSV二联RT-PCR检测方法的建立

参照GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)基因保守序列,设计2对特异引物,通过对最佳反应条件的优化,建立了CSFV和PRRSV的二联RT-PCR检测方法,该方法可同时扩增得到2条与试验设计相符的443 bp(CSFV)和246 bp(PRRSV)特异性条带。应用该二联RT-PCR方法检测猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结果均为阴性,证明该方法有良好的特异性。将已知阳性病毒PCR模板最高稀释倍数作为PCR的敏感度,结果表明该二联RT-PCR体系扩增的敏感度为10-3,可对CSFV和PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够同时快速诊断猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)2种传染病的方法,根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核苷酸序列,分别设计并合成2对能特异性扩增CSFV、PRRSV的引物,经过条件优化后,建立了检测CSFV、PRRSV的双重RT-PCR方法,扩增2种病毒的片段,大小分别为508bp和432bp.试验证明,该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,简便、快速、高效,为CSFV与PRRSV的快速诊断及进一步的CSFV与PRRSV的流行病学研究提供了重要的技术支持.     

多重实时定量PCR快速检测PRRSV、CSFV和PCV2混合感染方法的建立

根据TaqMan复合荧光探针设计原则,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物和探针,优化反应条件,建立了检测PRRSV、CSFV和PCV2的单项和多重Real-time PCR方法。结果表明,建立的方法具有高度特异性,与其他病原检测无明显交叉反应;对阳性质粒和病毒的最低检测量分别为<101个拷贝和<1TCID50/反应,检测灵敏度比常规PCR检测高100倍。通过对20份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果一致。建立的多重Real-time PCR方法可用于同时快速检测PRRSV、CSF和PCV2的混合感染,具有灵敏、特异、重复性好并能对样品进行定量检测等优点。     

高致病性PRRSV缺失变异株Nsp2基因的克隆与遗传变异分析

从湖南省内多个出现疑似猪“高热病”症状的猪场采集病料70份,采用RT-PCR方法进行分子流行病学调查．结果检出PRRSV阳性病料54份,阳性率高达77．14％（54／70）．对其中8份分别来自娄底、浏阳、永州、双峰、益阳、株洲、宁乡和溆浦的病料中的PRRSV基因组Nsp2高变区部分基因片段进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析．与国内外美洲型PRRSV分离株比较,序列相似性为72．2％～100％,其中,与公布的高致病性PRRSV缺失变异毒株的同源性最高,序列相似性为98．2％-100％．序列分析表明,这些毒株均是天然存在缺失的变异毒株,其Nsp2均有2个部位出现了缺失,分别为编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失和编码29个氨基酸的连续87个核苷酸的缺失,与高致病性PRRSV缺失变异毒株序列的缺失情况完全一致,且与其具很高的同源性,从而确定了分离的毒株均为引起猪“高热病”的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株,这是国内外少见的PRRSV缺失变异及毒力显著增强的现象．     

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp、430 bp和1 015 bp目的片段.以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR.CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性.以β-actin为对照,利用本方法检测了174份临床样品(血清、肺脏和胎儿),其结果为:PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为30.4%、4.6%和1.7%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为1.7%.同时对临床样品中CSFV、JEV和PRRSV阳性PCR产物进行测序分析,发现CSFV、PRRSV和JEV的PCR产物序列和NCBI数据库中目标基因的同源性分别为92%、90%和89%,这证实了多重PCR的阳性结果为上述3种病毒.结果证明,所建立的多重RT-PCR可用于临床检测.     

猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

2009年3月贵州省某猪场送检病猪3例,为确诊病因,进行了流行病学调查,实验室剖检病变观察,细菌学、荧光抗体和RT-PCR检测。经流行病学调查和剖检病变观察,该病例为疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒感染所致;该病例细菌分离鉴定结果为阴性,猪瘟直接荧光抗体检测结果为阳性,猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒RT-PCR核酸检测为阳性。表明,该病例为猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒及混合感染的诊治

针对贵州省遵义市某规模化猪场的发病情况,通过病理学观察、血液学和细菌学检查及病原核酸检测等方法,确诊该猪场发生了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒、猪瘟病毒、猪链球菌与猪附红细胞体的混合感染,经采取综合防治措施,控制了疫情.为进一步了解PRRS在贵州省各地区的流行情况、多种病原的混合感染情况及探索PRRS有效的防治方法提供理论依据.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪副嗜血杆菌混合感染的诊断

为弄清贵州某场猪发病猪的死亡原因,采用流行病学调查、临床症状观察、病理解剖诊断和RT-PCR检测核酸确诊等方法,对该场猪发病猪死亡原因进行了诊断。结果表明:流行病学调查和剖检病理初步诊断该猪场发病猪疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒和细菌混合感染,RT-PCR检测核酸确诊发病猪为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染,细菌培养、分离和生化特性鉴定确诊为猪副嗜血杆菌。造成该猪场猪发病死亡的原因为猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪副嗜血杆菌混合感染所致。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF5基因的克隆与表达

用RT-PCR方法从河南分离的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)变异株(HN07-1)中扩增ORF5全长基因,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明,该序列与标准美洲株VR-2332同源性为89%,与我国早期分离的BJ-4株同源性为88%,与HB-1、JXAI变异株同源性为96%和99%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,成功表达了41.5 kD的融合蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传变异研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是目前严重危害养猪业的一种传染病，呈世界性流行，该病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），不同PRRSV分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，这给PRRS的准确检测和有效控制带来困难，本文综述了近年来国内外关于该病毒不同分离株的遗传和变异情况，从基因组水平阐述了与病毒致病性关系较大的结构域，其中5'UTR,OIRF1中的Nsp2及ORF3和ORF5为变异较大的区域。     

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒活疫苗的安全性和体液免疫研究

采用转瓶生产技术,在MARC-145细胞中增殖PRRSV克隆20株,经过条件的优化选择,得到TCID50≥10^-7．55／mL的高滴度PRRSV溶液,为生产疫苗打下基础,所生产的PRRSV弱毒活疫苗对猪安全无致病性,能刺激猪产生特异性抗体应答,接种后第14天可检测出特异性中和抗体。疫苗内的PRRSV滴度在冻干前后变化不大,冻干疫苗在4～8℃保存有效期为6个月,-20℃保存有效期达18个月,表明生产的PRRSV弱毒活疫苗对猪安全且能刺激猪产生体液免疫应答,可用于PRRS的预防接种。     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型毒株的基因序列设计了一对特异性引物P1/P2,扩增的片段为550bp,根据欧洲型毒株设计了一对特异性检测引物P3/P4,扩增的片段为433bp,建立PRRSV的RT-PCR的检测与血清型鉴别方法。特异性试验表明,这2对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RNA或DNA。敏感性试验表明,这2对引物可以分别到检测10-5TCID50和10-4TCID50的病毒含量。利用该方法对重庆、四川某些猪场中临床上疑似为PRRS的20份送检组织样品进行检测,只有引物P1/P2能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物;其中有15份样品呈PRRSV阳性结果,阳性率为75%,说明送检的样品感染的PRRSV为美洲型。试验结果表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,是临床上对PRRS进行快速诊断和分子流行病学调查的实用方法。