羊驼催乳素受体基因(PRLR)exon10的克隆与序列分析

通过氰仿／异戊醇法从羊驼血液和组织中提取羊驼基因组DNA，首次扩增出羊驼PRLR基因（Prolactin Receptor，PRLR）exon10序列（GenBank登录号为DQ206831），并与其它动物相应区域作了同源性比较，结果表明：羊驼PRLR基因exon10的开放阅读框为1133bp，包括1046bp的编码区和87bp的拖尾区；同源性比较显示，羊驼PRLR基因exon10的核苷酸序列与哺乳动物（牛、绵羊、猪、狗、兔、大鼠等）的同源性较高，达80％，氨基酸序列的同源性则≥66％，而与鱼类的同源性则较低，仅为40％～45％。     

内皮素受体B在不同毛色羊驼皮肤中的表达与定位

研究内皮素受体B(endothelin recepter B,EDNRB)在羊驼皮肤中的表达与定位,以及在不同毛色中的差异比较,探讨其在羊驼毛色形成中的作用及其相关机制。以不同毛色的成年羊驼为研究对象,用RT-PCR法检测EDNRB基因在不同毛色皮肤中的表达,并使用实时荧光定量PCR技术分析不同毛色羊驼皮肤EDNRB基因的相对表达量,采用Western blot法和免疫组织化学法对EDNRB在羊驼皮肤中的表达进行定位和半定量分析。荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中EDNRB基因的相对表达量是白色羊驼的2.1651倍;Western blot结果显示EDNRB蛋白在棕色组的表达显著高于白毛组(P0.05);免疫组化试验结果显示,EDNRB在羊驼皮肤的毛乳头、毛根鞘及表皮细胞中均有表达,且在棕色皮肤组织中显著表达(P0.05)。试验结果提示,EDNRB与羊驼黑色素细胞的活动密切相关,并参与了羊驼毛色和肤色的形成。     

羊驼皮肤中可溶性鸟苷酸环化酶的表达差异

采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和Western blotting对可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)在棕色和白色羊驼皮肤中的表达差异进行了研究,以探讨sGC在羊驼皮肤中的作用。实时荧光定量PCR结果显示,sGC在棕色羊驼皮肤中的相对表达量较低,是其在白色羊驼皮肤中的表达量的0.16倍,且差异极显著(P<0.01);Western blot-ting结果显示,在羊驼皮肤总蛋白中含有与兔多克隆抗体发生免疫阳性反应的条带,在棕色皮肤中的反应阳性弱于白色皮肤,且差异极显著(P<0.01);免疫组织化学结果表明,sGC免疫阳性主要分布在白色羊驼皮肤毛囊的毛球上方细胞及细胞间质,而在棕色羊驼皮肤毛囊中,sGC免疫阳性主要分布在毛球底部和外根鞘细胞及细胞间质。结果提示sGC参与羊驼毛色形成。     

羊驼皮肤角蛋白基因家族的表达

为了揭示羊驼皮肤结构发生和皮肤生理的分子机制,对构建的皮肤cDNA文库进行了大规模的测序,以对羊驼皮肤的结构基因--角蛋白基因家族进行基因水平的表达分析.通过构建羊驼皮肤cDNA文库的基因表达谱,发现了羊驼皮肤结构基因角蛋白的表达具有以下特点:keratin家族有7个家庭成员表达,其中上皮角蛋白类型I keratin10表达丰度最高,而上皮角蛋白类型Ⅱ表达丰度较低;毛干特异性上皮角蛋白以类型I keratin 25低表达为主;毛发角蛋白以类型I keratin 40低表达为主.这些基因的表达对维持羊驼皮肤及其衍生物(毛发)的正常生理起着重要的作用.     

蛋白酶激活受体-2基因mRNA在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中的转录分析

蛋白酶激活受体-2(Protease-activated receptor-2,PAR-2)是表达于角质化细胞的膜受体蛋白之一,经证实参与黑色素颗粒的胞间转运,本文通过分析PAR-2基因在不同毛色羊驼皮肤组织中的mRNA转录水平,以期从色素颗粒转运角度研究羊驼不同颜色被毛形成机制。以4头成年白色羊驼和4头棕色羊驼为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,对PAR-2在白色和棕色羊驼皮肤中的mRNA表达水平进行研究。结果显示,PAR-2基因mRNA在棕色羊驼皮肤组织中的相对基因表达量是白色羊驼的2.43倍。结果提示,PAR-2基因mRNA在白色和棕色羊驼皮肤组织中的表达差异表明:毛囊黑色素细胞与角质形成细胞间色素颗粒转运水平是羊驼不同被毛颜色形成的机制之一。     

黑素皮质素受体1(MC1R)在不同毛色羊驼皮肤组织中的表达与定位研究

旨在通过研究黑素皮质素受体1(MC1R)在羊驼皮肤组织中的定位与表达,探讨其在羊驼毛色形成中的作用机制及与毛色的相关性。选用成年白色羊驼与棕色羊驼为研究对象,采用免疫组织化学方法及免疫印迹法(Western blotting),对MC1R在羊驼皮肤中的表达进行定位和定量分析。结果,(1)免疫组化结果显示,MC1R蛋白在白色和棕色羊驼皮肤表皮、毛囊周围外根鞘组织、毛乳头以及毛球周围都呈阳性着色。在棕色羊驼,阳性表达部位主要分布于毛球顶部及表皮,呈强阳性着色。在白色羊驼,阳性表达部位主要在外根鞘及表皮,毛球部表达呈弱阳性。MC1R在棕色羊驼皮肤组织中极显著表达(P<0.01)。(2)Western blotting结果显示,羊驼皮肤组织粗蛋白提取物中存在分子量约35ku与兔抗MC1R多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,且棕色羊驼平均蛋白表达量显著高于白色羊驼,差异极显著(P<0.01)。MC1R在羊驼皮肤组织中的定位与表达量的不同与羊驼毛色表型之间存在一定的相关性。     

羊驼皮肤中核糖体蛋白L41的表达

为了研究羊驼皮肤中核糖体蛋白L41(RPL41)基因的序列结构特点及功能,用Southern blot技术从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出RPL41基因,测序后通过生物信息学方法对该基因进行了相关分析。经分析发现羊驼RPL41基因序列中存在CCGG位点,推测羊驼RPL41基因在此位点发生甲基化。表明RPL41基因可能参与皮肤细胞凋亡及毛生长周期的调节。     

不同代次羊驼皮肤黑素细胞TYR基因表达变化的研究

为了探讨TYR基因在体外培养的羊驼皮肤黑素细胞不同代次间表达变化差异,根据Gen Bank中已发现的序列(EU293064)设计引物和探针,以羊驼皮肤黑素细胞的RNA为模板,采用QRT-PCR Taq Man探针法研究羊驼酪氨酸酶基因在不同代次间羊驼皮肤黑素细胞中m RNA表达量.结果表明,经过内参基因校正后,第10代羊驼黑素细胞中TYR基因的相对表达量是第3代细胞相对表达量的25倍(P0.01),第10代细胞与第5代细胞表达差异不明显(P0.05)。表明TYR基因表达量的差异与羊驼皮肤黑素细胞传代可能存在一定的相关性。     

在羊驼皮肤黑色素细胞中α-黑素细胞刺激素对诱导一氧化氮合酶的影响

为研究α-黑素细胞刺激素（α-Melanocytestimulatinghormone,α-MSH）对诱导型一氧化氮合酶（NOS2）在羊驼皮肤黑素细胞中的影响。采用体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,检测不同浓度α-MSH（0、10-9、10^-8、10^-7moL／L）对羊驼皮肤黑素细胞中诱导型一氧化氮合酶（NOS2）基因...     

不同被毛颜色羊驼皮肤组织中成熟黑色素细胞的组织学分析

羊驼是已知家养动物中天然被毛颜色最为丰富的动物之一,本研究旨在在组织水平上观察不同被毛颜色羊驼皮肤组织中成熟黑色素细胞的分布与定位,以揭示羊驼丰富被毛颜色发生的细胞学机制。试验选择白色被毛和有色被毛成年羊驼各1头,盛毛期体侧取样,制备石蜡切片,分别采用多巴染色、甲苯胺蓝染色及多巴—甲苯胺蓝复染,光镜观察、拍照。结果表明,在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中均有成熟黑色素细胞的分布,但是分布规律不同,在有色被毛皮肤组织主要分布于毛根成形部,在毛根永久部及表皮也有分布,但是数量较少;白色被毛组织主要分布于表皮,在毛根成形部分布很少,而在真皮部及毛根永久部有少量分布。结果提示:1)羊驼不同被毛颜色发生取决于毛根成形部成熟黑色素细胞的数量;2)从一个侧面佐证了毛囊黑色素细胞与皮肤黑色素细胞在执行功能以及它们所接受的调节信号是不同的。     

Assessment of Sperm Function Parameters and DNA Fragmentation in Ejaculated Alpaca Sperm (Lama Pacos) by Flow Cytometry

Flow cytometry has been shown to be an accurate and highly reproducible tool for the analysis of sperm function. The main objective of this study was to assess sperm function parameters in ejaculated alpaca sperm by flow cytometry. Semen samples were collected from six alpaca males and processed for flow cytometric analysis of sperm viability and plasma membrane integrity using SYBR‐14?PI staining; acrosomal membrane integrity using FITC‐conjugated Pisum Sativum Agglutinin?PI labelling; mitochondrial membrane potential (Δψm) by staining with JC‐1 and DNA Fragmentation Index (DFI) by TUNEL. The results indicate that the mean value for sperm viability was 57 ± 8 %. Spermatozoa with intact acrosome membrane was 87.9 ± 5%, and viable sperm with intact acrosomal membrane was 46.8 ± 9%, high mitochondrial membrane potential (Δψm) was detected in 66.32 ± 9.51% of spermatozoa and mean DFI value was 0.91 ± 0.9%. The DFI was inversely correlated with high Δψm (p = 0.04; r = ?0.41) and with plasma membrane integrity (p = 0.01; r = ?0.47). To our knowledge, this is the first report of the assessment on the same sample of several parameters of sperm function in ejaculated alpaca sperm by flow cytometry.     

幼龄雄性羊驼脑垂体结构的研究

本研究旨在观察7月龄雄性羊驼脑垂体的组织结构,为研究其内分泌功能提供形态学依据。3只7月龄未性成熟的雄性羊驼,解剖取出脑垂体制作标本,应用光镜和透射电镜技术观察其结构。结果显示,羊驼垂体位于颅底蝶骨构成的很浅的垂体窝内,与水牛相似,为椭圆形小体,背侧平,腹侧凸,由腺垂体(包括远侧部、结节部和中间部)和神经垂体组成,存在垂体裂和不发达的垂体腔;远侧部约占矢状总面积的近40%～45%,中间部和神经部也较发达;远侧部嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嫌色细胞所占比例为8∶1∶11;电镜下观察到羊驼脑垂体远侧部中的生长激素细胞、促甲状腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促性腺激素细胞和滤泡细胞,且生长激素细胞数量最多。结果提示,7月龄雄性羊驼脑垂体结构与大多数哺乳动物相似,但有其特有的结构特征。     

Mapping of Neurotensin in the Alpaca (Lama pacos) Brainstem

We studied the distribution of cell bodies and fibres containing neurotensin (NT) in the brainstem of the alpaca using an indirect immunoperoxidase technique. Immunoreactive fibres were widely distributed throughout the brainstem, whereas the distribution of cell bodies was less widespread. Immunoreactive perikarya were only found in the mesencephalic and bulbar reticular formation, periaqueductal grey, nucleus of the solitary tract, laminar spinal trigeminal nucleus and in the inferior colliculus. A high density of fibres containing NT was found in the dorsal nucleus of the raphe, marginal nucleus of the brachium conjunctivum, locus coeruleus, inferior colliculus, inter‐peduncular nucleus, substantia nigra, periaqueductal grey, reticular formation of the mesencephalon, pons and medulla oblongata, nucleus of the solitary tract, laminar spinal trigeminal nucleus, hypoglossal nucleus, inferior central nucleus and in the tegmental reticular nucleus. The widespread distribution indicates that NT might be involved in multiple physiological actions in the alpaca brainstem; this must be investigated in the future as alpacas lives from 0 m above sea level to altitudes of up 5000 m and hence the involvement of this neuropeptide in special and unique regulatory physiological mechanisms could be suggested.     

Cloning of PRL and VIP cDNAs of the Java sparrow (Padda oryzivora)

Complementary DNA (cDNA) of prolactin (PRL) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) of the Java sparrow were cloned and sequenced. The proximal region of the PRL promoter was also identified. Java sparrow PRL was found to have 88.3, 88.3, and 89.1% sequence identity at the cDNA level to PRL of chicken, turkey, and duck, respectively. The predicted amino acid sequence had an overall similarity with a comparable region of chicken (91.4%), turkey (88.9%) and duck (92.0%) PRL. Based on the cDNA sequence and genomic structure of the chicken PRL gene, the proximal promoter was characterized. Sequence analysis of the proximal region of Java sparrow PRL promoter revealed a high degree of similarity to that of chicken, turkey and duck PRL promoters. Moreover, cDNA of prepro-VIP was also cloned and sequenced. Java sparrow prepro-VIP shows high similarity to chicken and turkey prepro-VIP. However, the region upstream of the 5' untranslated region of Java sparrow prepro-VIP did not show similarity to that of chicken. These results suggest that the mechanisms, which regulate expression of the VIP gene, may be different between precocial and altricial birds, but expression of the PRL gene may be widely conserved in avian species.     

妊娠期山羊腺垂体中催乳素促卵泡素和促黄体素的分布特点

为了阐明妊娠期垂体中催乳素(PRL)、促卵泡素(FSH),促黄体素(LH)的分布和三者之间协调关系.本试验采用免疫组化SP法检测了PRL、FSH,LH三种激素在妊娠各期山羊的腺垂体细胞中免疫反应产物的分布特点.结果显示,在山羊妊娠过程中,腺垂体中PRL阳性细胞多存在于远侧部,数量逐渐增多,胞质呈强阳性;FSH和LH阳性细胞分布在远侧部和结节部,FSH胞质内颗粒着色深浅不一,LH多核膜着色;相对表达量都逐渐升高,而升高程度不同,表现为妊娠后期LH表达量急剧升高,FSH则变化较小,除了FSH的相对表达量在妊娠前期和中期之间无显著差异(P>0.05)外,3种激素的相对表达量在妊娠前期、中期和后期3个时期之间都存在显著差异(P<0.05),妊娠前、中期FSH的相对表达量均高于PRL和LH,妊娠后期LH的表达量最高.FSH次之,PRL最低.提示PRL,FSH和LH三种激素相互协同以促进胚胎着床并维持妊娠,而且在妊娠早期PRL起主要作用,之后协同FSH和LH维持妊娠.     

羊驼胎盘中GH和PRL含量的测定

为了更好的研究羊驼胎盘的再利用,采用放射免疫分析(RIA)方法测定羊驼产后胎盘中生长激素(GH)和催乳素(PRL)的含量,对羊驼产后胎盘中GH和PRL的表达量进行了精确定量。RIA法测定结果显示,平均每只羊驼胎盘含GH为13.084 5 ng,含PRL约153.3μg,结果提示,羊驼胎盘可作为除垂体外GH和PRL,尤其是PRL天然产物的来源。