奶牛乳房炎抗性基因TAP cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽(TAP)基因,重组到pMD19-T Simple载体中,并进行序列分析。序列分析结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框(ORF) 195 bp,与牛TAP基因同源性达93.8%;该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。     

佳米驴β防御素aBD-1基因克隆及序列分析

为获得佳米驴β防御素-1(aBD-1)的全长cDNA序列,为开发其药用功能积累资料。从佳米驴舌黏膜上皮组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出aBD-1(ass-βdefensin-1)cDNA的中间片段后,再采用RACE法,扩增佳米驴β防御素aBD-1的cDNA全序列。aBD-1 cDNA全序列长为360 bp,其中包含192 bp的开放阅读框,37 bp的5′非翻译区(5′UTR),102 bp的3′非翻译区(3′UTR)以及poly(A)26。在GenBank上注册号为EU265778,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与马β防御素eBD-1、牛的β防御素TAP、绵羊的β防御素sBD-1、猪的β防御素pBD-1和人的β防御素hBD-2的同源性分别为92%、68%、75%、75%和68%。aBD-1全长cDNA是β防御素家族中的一个新基因。     

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的克隆及序列分析

β防御素是一类富含半胱氨酸的抗微生物多肽，主要表达在哺乳动物黏膜上皮内。我们发现了一种新的β-防御素-骆驼防β-御素-1(caBD-1)。从骆驼舌黏膜上皮组织中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出caBD-1的cDNA，并重组到pBlueselect T载体，经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定，证实所克隆的caBD-1的cDNA为β-防御素，因为该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF)，该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素，该前原防御素含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氮酸残基。骆驼β-防御素的发现对我们更好地理解骆驼黏膜防御机制有很大帮助。     

马鹿β-防御素-1cDNA全长克隆、序列信息及表达分析

为了研究马鹿β-防御素-1(Red deerβ-defensin-1,redBD-1)基因的结构与功能,揭示该基因的组织表达规律。本研究利用PCR结合RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术从马鹿舌黏膜中克隆redBD-1基因的cDNA全长序列并对其进行了生物信息学分析,同时采用Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)技术检测该基因在各组织的表达情况。结果表明,redBD-1基因的cDNA全长序列为455bp,开放阅读框(ORF)为192bp,编码64个氨基酸。生物信息学分析表明,redBD-1蛋白的理论分子量为6.94ku,有10个带正电荷的氨基酸残基,无带负电荷的氨基酸残基,理论等电点为10.85。预测redBD-1蛋白有一个分泌信号肽结构,无跨膜区,主要在细胞外发挥生理功能;6个保守的半胱氨酸残基分别以Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6连接形成3个分子内二硫键;成熟蛋白的三级结构是由β-折叠、延伸和无规则卷曲构成。redBD-1基因编码的氨基酸序列同源性最高的是梅花鹿β-防御素(siBD-1)为98.4%,其次是水牛肠β-防御素(BEBD)为92.2%,与人β-防御素-2(HBD-2)同源性最低仅为35.9%。RT-qPCR结果得出,redBD-1在被检器官中均有表达,在消化系统、呼吸系统以及生殖系统的大部分器官表达量较高,肝、肾和脾等实质性器官表达量相对较低。本试验为今后深入研究防御素基因功能以及马鹿黏膜免疫系统提供理论依据。     

驯鹿β-防御素reBD-1 cDNA的克隆及序列分析

从驯鹿舌黏膜上皮组织中提取总RNA，采用RT—PCR技术扩增出reBD-1的cDNA，并重组到pBlueselect T载体，经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定，证实所克隆的reBD-1的cDNA为β-防御素，因为该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框（ORF），该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素，该前原防御素含有伊防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。驯鹿β-防御素属首次发现，为更好地了解驯鹿黏膜防御机制有很大的帮助。     

塔里木马鹿雌性生殖道黏膜β-防御素(TWSBD-1)基因扩增及序列分析

为了从塔里木马鹿的子宫黏膜上皮组织中提取总RNA,以此RNA为模板进行RT-PCR,根据已获得的梅花鹿β-防御素siBD-1基因序列设计并合成引物,采用RT-PCR技术进行扩增,双向克隆测序。结果表明:该基因序列为塔里木马鹿雌性生殖道黏膜β-防御素(TWSBD-1),包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF),编码64个氨基酸残基的前原防御素,其中6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基,符合β-防御素特征性结构。     

蒙古绵羊β-防御素-1cDNA的扩增及其序列分析

为了获得蒙古绵羊β-防御素-1（sBD-1）的cDNA序列,从蒙古绵羊瘤胃的上皮组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出sBD-1的cDNA。结果 sBD-1的cDNA长为300bp,该cDNA包含由192bp组成的开放读码框（ORF）,ORF编码64个氨基酸的前原防御素。经过DNA序列分析。证实所扩增的cDNA为sBD-1。     

荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素基因克隆及其原核表达质粒的构建

根据已发表的牛β-防御素基因序列设计引物,从具有临床乳腺炎症状的荷斯坦奶牛血液中性粒细胞中提取RNA,克隆牛β-防御素基因并插入到原核表达载体pQE-30中,构建了原核表达质粒pQE-30/β-defesion。测序结果表明,克隆的目的基因长189bp,编码1个氨基酸,与已报道的牛β-防御素氨基酸序列同源性达95.6%。本研究为牛乳腺防御素的表达及功能、活性的研究奠定了一定的基础。     

骆驼β-防御素caBD-1全长cDNA的扩增

获得全长cDNA 序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的前提.我们根据已获得的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的已知序列设计一条上游引物,反转录引物中的部分序列即3′末端序列.另外,采用反向嵌套PCR RACE法,根据caBD-1 cDNA的已知序列,设计一条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA 进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功的克隆了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的5′末端序列.本研究扩增出的caBD-1 cDNA序列全322 bp,其中包含一个由192 bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸残基的前原caBD-1肽.     

猪圆环病毒2型辽宁分离株ORF2基因的克隆与序列分析

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原.猪圆环病毒2型有11个开放阅读框(ORF),其中ORF1和ORF2是最主要的开放阅读框.试验参照国内发表的猪圆环病毒2型分离株的核苷酸序列设计合成了1对引物,对猪圆环病毒2型辽宁株ORF2基因进行PCR扩增、克隆、序列分析,并与GenBank中的猪圆环病毒2型参考毒株ORF2基因进行同源性分析,为进一步建立该病的快速检测方法及分子流行病学研究奠定基础.     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—K99／LacZ基因重组的研究

将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。     

猪Haln基因与H-FABP基因研究

本文就Hal^n基因和猪应激综合征的发生机制及其对内质的影响、H-FABP和H-FABP基因与IMF含量关系的相关研究以及两种基因的PCR-RFLPs检测作一综述，旨在为肉质的进一步研究提供基础资料和理论依据。     

山羊Myostatin基因打靶载体的构建

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1.4kb、4.5kb.将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%.对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建表达Neo、Tk基因的哺乳动物双标记转基因载体,并命名为ploxp-M .     

基因枪转化技术在动物转基因中应用的研究进展

基因枪转化技术无论在动物还是植物方面都产生了巨大的影响,因粒子介导的转基因方法简单、安全、高效,而越来越被人们所重视。研究结果表明,该转化技术不仅能够用于组织、细胞、器官,甚至可用于一些较难转染的靶目标,同时还可用于体内和体外信息的转换。目前手提式基因枪已广泛应用于皮肤、组织、各种细胞或内脏器官的转染,应用最广的领域是基因治疗,主要包括基因免疫和抑制肿瘤生长。近几年,基因枪技术发展迅速,应用范围越来越广,已经取得了丰硕的成果。作者主要叙述了基因枪转化的基本原理及近年来人们对基因枪转化技术条件的改进,同时就基因枪在动物转基因中的应用和一些主要的研究成果作了阐述,主要包括利用基因枪基因免疫、基因治疗、自杀基因治疗癌症、胚胎转基因、各种动物细胞和器官组织转基因等,并对基因枪技术在动物上应用的优势和不足进行了一些分析,最后展望了基因枪转化技术在动物中的应用前景。     

促性腺激素释放激素基因及其受体基因的研究进展

作者简要介绍了促性腺激素释放激素基因及其受体基因的位置、结构、表达、调控机理,并初步探讨了这两个基因与繁殖性能的关系。     

抑制素基因免疫大鼠的免疫应答与基因表达

为了研究抑制素基因免疫对大鼠免疫应答和发情的影响及免疫后抑制素的组织分布,将60只大鼠分为5组,每只分别肌肉注射10（T1）、50（T2）、100μg pCIS（T3）,50μg pcDNA3.1（V）和生理盐水（S）。ELISA检测抑制素抗体水平,阴道涂片法检测大鼠的发情状况,免疫组化分析抑制素的组织分布。结果显示,不同剂量抑制素基因2次免疫10 d后抗体P/N值均显著升高（P〈0.05）,3次免疫10 d后T2和T3组抗体P/N值进一步显著升高（P〈0.05）,T3组抗体水平有高于T1和T2组的趋势（P〉0.05）;抑制素基因免疫对大鼠的发情无显著影响;3次免疫2周后心脏、肝脏、接种肌肉部位均未检出抑制素;卵巢、肾脏和垂体部位均检出抑制素;而脾脏部位,抑制素质粒免疫组检出抑制素,对照组则未检出抑制素。这些结果表明,免疫剂量和次数的增加没有导致大鼠产生明显的抑制素免疫耐受,抑制素基因免疫大鼠是相对安全的,抑制素的组织分布结果亦为抑制素基因免疫的作用机理研究提供了理论依据。     

猪流行性腹泻病毒S基因与SEA基因融合表达及免疫原性评价

试验旨在构建pET-28a-S-SEA融合表达质粒,并评价S-SEA蛋白的免疫原性。根据大肠杆菌密码子偏嗜性,对我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株(GenBank:LT906620.1)的S基因与金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因(GenBank:MH053151.1)进行优化,通过柔性连接肽(GGGGS)连接后,克隆至表达载体pET-28a,得到pET-28a-S-SEA重组质粒,转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测后,对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,将亲和层析后的重组蛋白,免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,对免疫小鼠的血清特异性抗体水平和淋巴细胞增殖指数进行检测。结果成功构建pET-28a-S-SEA质粒,且在大肠杆菌中获得高效表达;小鼠试验结果表明,纯化的S-SEA蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,促进淋巴细胞增殖,具有良好的免疫原性,为进一步研究猪流行性腹泻亚单位疫苗提供帮助。     

精子载体法获得转人her2基因猪

将带有外源基因的载体酶切纯化后与去精清的猪新鲜精液按比例混合，17℃静置处理使外源DNA进入精子头部，通过人工授精使受体母猪怀孕后产下20头仔猪，经PCR特异性片段扩增，特异片段序列测定和比对，共4头PCR结果为阳性。初步证明人her2基因已在猪染色体上整合，其整合率约为20％。本研究利用精子载体法成功获得了转基因阳性猪，为大动物的转基因研究提供了理论与实践的参考。     

牛对氧磷酶1基因和对氧磷酶2基因原核表达载体的构建及其表达分析

为制备和纯化对氧磷酶(PON1和PON2)蛋白做准备，对牛的PON1和PON2基因进行克隆并在大肠杆菌中表达。从牛肝脏组织中用RT-PCR扩增PON1和PON2 cDNA的全长编码序列，连接到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，以IPTG诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE分析表达情况。 结果表明，成功克隆了PON1和PON2两个基因的cDNA的全长编码序列，酶切及测序鉴定证明，获得含有目的基因片段的重组质粒，表达的牛的PON1和PON2融合蛋白以可溶性的形式存在。这为进一步制备和纯化PON1和PON2蛋白，以及探索其在家畜使用寿命中的研究和提高犊牛初生重的作用等方面提供依据。