玉米ZmCKX1基因的克隆及功能分析

利用RT-PCR技术,从玉米自交系郑58中克隆了编码细胞分裂素氧化酶1的基因(Zm-CKX1),该基因阅读框全长为1 608bp,编码535个氨基酸,蛋白质分子量为57kD,理论等电点pI=5.22。该基因与TaCKX1、AtCKX在核苷酸水平上同源性分别为69%、49%。通过实时荧光定量PCR的方法对该基因的表达模式进行了分析,结果表明,在玉米雌穗中随着授粉时间的延长,ZmCKX1基因表达量逐渐升高,并且ZmCKX1基因在郑单958及其亲本、安玉5号及其亲本雌穗中的表达量明显不同,表现为超低显性表达模式。因此推断,ZmCKX1基因可能是一个与杂种优势相关的基因。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

蒺藜苜蓿低温胁迫响应基因MtbHLH-1的克隆及功能分析

【目的】克隆蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）低温胁迫响应基因MtbHLH-1,并对其进行序列特征分析,研究MtbHLH-1对牧草蒺藜苜蓿耐低温能力的影响。【方法】利用RT-PCR技术获得蒺藜苜蓿MtbHLH-1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR研究MtbHLH-1的低温（4℃）表达模式。【结果】测序结果显示,cDNA片段全长778 bp,包含一个741 bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸残基,命名为MtbHLH-1,GenBank登录号为JN800447。氨基酸BLAST分析表明,MtbHLH-1氨基酸序列与已报道的其它植物（大豆、拟南芥、烟草、小麦和玉米等）bHLH氨基酸序列具有45%-73%相似性。半定量RT-PCR研究表明,MtbHLH-1在低温胁迫条件下上调表达。【结论】从蒺藜苜蓿中克隆了低温胁迫碱性/螺旋-环-螺旋转录因子MtbHLH-1,半定量分析表明其在蒺藜苜蓿抗冷过程中起作用。     

野生茄子托鲁巴姆StLTPa7的克隆与分析

【目的】从野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）中克隆非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7 cDNA,并解析其功能。【方法】采用同源基因设计引物,并根据RT-PCR方法克隆StLTPa7 cDNA序列;通过农杆菌浸染法转化烟草,构建StLTPa7过表达转基因烟草植株;采用菌丝生长速率法检测转基因烟草植株蛋白提取物对大丽轮枝菌的体外抑菌活性。【结果】托鲁巴姆中克隆获得1个StLTPa7 cDNA序列,该序列含有1个345 bp的开放阅读框,推测编码长114个氨基酸的蛋白,相对分子量为11.42 kD,理论等电点为9.01。StLTPa7受水杨酸（SA）和大丽轮枝菌诱导表达,在处理后24和48 h的表达量较高。为了分析StLTPa7对大丽轮枝菌的抗性,构建了过表达转基因烟草植株,共获得了4个PCR阳性转StLTPa7烟草株系。荧光定量PCR分析显示,该基因在转基因烟草株系L5和L7中过量表达。抑菌试验显示,转基因烟草株系L5蛋白提取物对大丽轮枝菌的抑菌率约为对照的2.5倍。【结论】从野生茄子托鲁巴姆中克隆到1个StLTPa7 cDNA序列,该基因与大丽轮枝菌的生长和增殖的抑制作用相关,可能参与植物对大丽轮枝菌的防卫过程。     

杉木蔗糖转运蛋白SUT基因的克隆和功能分析

蔗糖转运蛋白又称蔗糖-质子共转运蛋白,简称SUT(sucrose transporter)或者SUC(sucrose carriers),主要担负植物光合产物——蔗糖的跨膜运输与分配调控,在植物体内完成使蔗糖从“源”到“库”的运输。采用CTAB法提取杉木总RNA,通过RT-PCR得到cDNA,设计基因特异性引物,从1年生无性系杉木幼苗嫩叶中克隆SUT基因,并利用生物信息学方法分析SUT的基本结构、进化关系、理化性质。结果表明,在电泳图上总RNA的结构完整,28 S的亮度约为18 S的2倍;A260/A280为2.20,A260/A230为2.31;杉木SUT基因编码区全长为1 782 bp,共编码593个氨基酸,是具有SUT基因家族的典型12个跨膜区;通过系统进化树的分析发现,杉木SUT与无油樟SUT的亲缘性较高,SUT蛋白属于疏水性蛋白。     

油菜FAD2 基因的克隆与功能分析

油酸去饱和酶FAD2基因催化C18∶1脂肪酸脱氢生成C18∶2脂肪酸,直接决定了油料作物的油脂品质,同时对植物的抗冻能力至关重要。通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种"中双9号"中克隆了Bn FAD2基因的全长c DNA序列,该基因编码一个长384aa的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子量44.2 ku,等电点p I值为8.54,对应的基因组序列无内含子。使用荧光定量RT-PCR发现它在种子发育到25 d时转录水平最高;使用生物信息学手段发现该蛋白具有6个跨膜区,定位在内质网膜上,不含信号肽。将该基因克隆到植物转基因载体p BILP2PTNap中,通过农杆菌LBA4404介导转化了拟南芥fad2基因突变体,使其在种子中超量表达,共获得20株转基因阳性植株。使用气相色谱法比较野生型植株、突变体植株、转基因阳性植株种子中脂肪酸的组成成分,结果发现转基因前后,种子中油酸(C18∶1)的含量从53.8%降低到12.4%~34.1%,亚油酸(C18∶2)含量从2.9%提高到11.5%~62.7%,说明这些转入的Bn FAD2基因在不同植株中均能不同程度地互补fad2突变体的表型,证明克隆得到的油菜Bn FAD2基因具有完整的催化功能。     

茄子SmCOL5基因在花青素生物合成中的功能分析

通过同源克隆的方法从茄子中分离出SmCOL5基因,并对其蛋白功能进行分析。结果表明:SmCOL5蛋白定位于细胞核中;SmCOL5蛋白可与组成型光形态建成SmCOP1蛋白互作,说明SmCOL5蛋白的功能受到光的调控;且SmCOL5蛋白能与花青素生物合成途径中重要的结构基因SmF3H、SmCHS的启动子结合。推测SmCOL5基因在接收到光受体信号后参与茄子花青素生物合成的调控途径。     

紫甘蓝COP1基因的克隆及表达模式分析

光照是植物生长发育的一个重要的环境因素,COP1是光调控植物发育的一个分子开关。本实验以"早红"紫甘蓝为实验材料,分两组置于光照(光照16h,28℃;黑暗8h,18℃)及完全遮光培养箱培养,至幼苗时提取RNA,进行COP1的cDNA克隆,并通过半定量RT-PCR方法分析COP1在不同处理下的表达情况。结果表明:COP1 cDNA全长为1863bp,编码620aa,分子量为70.325kD;在无光条件下生长的紫甘蓝幼苗虽然仍有少量花青素合成,但是其花青素含量明显低于光照条件下生长的紫甘蓝幼苗;COP1基因在无光条件下的表达量明显强于有光条件,表明COP1对紫甘蓝中花青素的合成起负调控作用。本文旨在探索在不同光照条件下紫甘蓝中COP1基因与其花青素合成的关系,为后期揭示花青素表达调控机制奠定基础。     

低温胁迫对茄子的伤害及茄子抗寒机理

从膜损伤、ＡＯＳ代谢等方面研究低温胁迫对茄子的膜伤害,探索茄子的抗寒机理。试验结果表明,０￣５℃低温胁迫下,茄子叶片细胞膜透性增大,其相对电导率达２５．０５％￣５４．８０％;ＭＤＡ含量上升４６．５％￣８３．４％,细胞膜受损伤,ＳＯＤ和ＣＡＴ活性分别上升５．３９％￣３１．８１％和１１．０％￣７８．０％、ＰＯＤ活性保持相对稳定,茄子动员细胞膜保护系统清除ＡＯＳ。     

红叶芥低温胁迫下苯丙氨酸解氨酶活性及其基因的克隆表达

用8℃低温处理红叶芥四叶期植株,在低温处理的52 h内分别取样6次,取样后分别提取叶片总RNA,再利用RT-PCR克隆得到红叶芥PAL基因开放阅读框内1908 bp片段,核苷酸序列分析显示,红叶芥PAL基因与芜青PAL基因的同源性达到99%.半定量RT-PCR结果显示,在8℃低温胁迫下,红叶芥PAL基因表达量呈现先降低后升高的趋势,在处理18 h后达到最低点,随后迅速升高,这与PAL活性变化一致.

Abstract：

The 4-leaf seedlings of red-leaf mustard(Brassica juncea var.garrhiza Tsen et Lee)were exposed to low temperature(8 ℃)for 52 h,during which period leaf samples were taken 6 times for total RNA extraction.The open reading frame fragment that was generated by RT-PCR using specific primers was 1 908 bp.The cDNA from the leaves of red-leaf mustard was used as the template.Nucleotide sequence analysis showed that red-leaf mustard PAL gene shared 99% identity to that of Brassica napus.In response to the low-temperature stress in this experiment,the expression of PAL first dropped and then increased rapidly,being the lowest 18 h after the start of the treatment,a similar trend to that of PAL activity.     

雷州黑鸭PID1基因部分序列的克隆与蛋白功能分析

[目的]了解雷州黑鸭磷酸酪氨酸互作结构域1(phosphotyrosine interaction domain containing 1,PID l)基因的序列结构特征及其蛋白的功能,为利用其改善雷州黑鸭肉品质与提高肉风味提供分子理论依据.[方法]采用RT-PCR方法克隆雷州黑鸭PID1基因部分序列,测序后比对其同源性,构建系统发育树,并预测其蛋白结构与功能.[结果]该核苷酸序列长度为369 bp,编码80个氨基酸,且大多为疏水性氨基酸.与人、牛、鸡等物种进行同源性比对,发现雷州黑鸭PID1基因序列与鸡具有高度同源性,同源性高达94％,且雷州黑鸭与鸡聚于同一系统发育支.蛋白质结构预测表明,该蛋白无跨膜结构与信号肽,氨基酸序列呈疏水性,位于细胞质中.[结论]雷州黑鸭的PID1基因与鸡的亲缘关系最近,其蛋白主要功能是在细胞质中参与肌内脂肪沉积的调控.     

红叶芥低温胁迫下苯丙氨酸解氨酶活性及其基因的克隆表达

用8℃低温处理红叶芥四叶期植株,在低温处理的52 h内分别取样6次,取样后分别提取叶片总RNA,再利用RT-PCR克隆得到红叶芥PAL基因开放阅读框内1 908 bp片段,核苷酸序列分析显示,红叶芥PAL基因与芜青PAL基因的同源性达到99%.半定量RT-PCR结果显示,在8℃低温胁迫下,红叶芥PAL基因表达量呈现先降低后升高的趋势,在处理18 h后达到最低点,随后迅速升高,这与PAL活性变化一致.     

陆地棉盐胁迫应答基因GhPEAMT1的克隆及功能分析

【目的】磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferse,PEAMT)是植物磷酸胆碱合成的关键酶,而磷酸胆碱是可以增强植物抗性的甘氨酸甜菜碱合成底物胆碱的前体。通过对陆地棉磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因(GhPEAMT1)的克隆、表达模式分析,以及功能验证,探究GhPEAMT1在陆地棉响应盐胁迫中的生物学功能,为棉花耐盐品种的选育提供基因资源。【方法】根据转录组测序数据分析,最终确定GhPEAMT1为耐盐候选基因;通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因;通过生物信息学分析基因结构特征、预测蛋白质相对分子质量以及进化关系;利用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析耐盐棉花品种早熟长绒7号和感盐棉花品种南丹巴地大花在NaCl胁迫后不同时间点不同组织的表达特征;构建亚细胞定位载体,进行烟草的瞬时转化,确定蛋白质在细胞中的位置;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,分析转基因拟南芥种子在盐胁迫下的萌发率和转基因拟南芥主根长度;利用病毒诱导基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)对早熟长绒7号棉...     

低温胁迫对茄子幼苗APX活性的影响及cDNA序列克隆研究

[目的]探讨低温胁迫对茄子基因表达的影响。[方法]以三叶期茄子幼苗为材料,于(8±1)℃的低温下胁迫24、48、72、961、20 h,取茄子第2片叶测定APX活性及进行APX基因的cDNA克隆。[结果]结果表明:低温胁迫下APX活性先上升后下降,以胁迫处理72 h时酶活性最高;APX基因的cDNA序列测序结果显示该序列与烟草(Nicotiana tabacum L.)、菠菜(Spinacia oleracea L.)、辣椒(Capsicum annuum L.)、番茄(Lycopersicon esculentum L.)、长豇豆(Vigna unguiculata L.)、龙眼(Dimocarpus longan L.)等具有较高的同源性。[结论]APX在进化中具有较高的保守性。     

紫花苜蓿抗逆基因MsDUF的克隆及其功能分析

【目的】克隆紫花苜蓿（Medicago sativa L.）抗逆新基因MsDUF,并对其进行序列特征分析,了解该基因在逆境胁迫下的表达模式。【方法】利用RACE法获得紫花苜蓿MsDUF全长的cDNA序列,对该序列进行生物信息学分析;用基因枪法进行MsDUF的亚细胞定位分析;采用实时荧光定量PCR研究该基因在高含量NaCl和PEG-6000的胁迫下,以及ABA和GA3诱导下的表达模式。【结果】测序结果显示,该基因cDNA全长714 bp,包含一个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸,命名为MsDUF,GenBank登录号为JX183734。氨基酸BLASTP分析表明,MsDUF氨基酸序列与拟南芥、大豆和蒺藜苜蓿等具有53%—98%的相似性,属于DUF4228 superfamily。实时荧光定量PCR研究表明,该基因在逆境胁迫下上调表达。【结论】从紫花苜蓿中克隆了抗逆相关基因MsDUF,发现其定位于细胞质中,实时荧光定量PCR结果分析表明该基因在紫花苜蓿的抗逆反应中起着重要作用。     

紫花苜蓿NAC类转录因子基因MsNAC2的克隆及其功能分析

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因MsNAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解MsNAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿MsNAC2全长序列,并进行生物信息学分析。应用real-time PCR技术分析该基因在非生物胁迫下的时空表达特征。构建MsNAC2-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。同时构建pBI121-MsNAC2植物超表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶盘,比较逆境胁迫条件下野生型烟草和转基因株系的表型和生理指标,鉴定超表达MsNAC2对烟草耐逆能力的调控效应。【结果】MsNAC2全长1 358 bp,开放阅读框长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,编码蛋白质分子量为39.4 kD,其N端含有典型的NAC保守结构域,C端高度变异。进化树聚类分析表明,该基因与脐橙CsNAC亲缘关系较近,属于NAC蛋白的ATAF亚家族。洋葱亚细胞定位分析表明MsNAC2定位于细胞核。转录水平表达分析表明MsNAC2受250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000、0.1 mmol·L^-1 ABA和4℃胁迫诱导而显著升高,并且MsNAC2在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。抗性试验结果显示,在NaCl、PEG和4℃冷害胁迫下,转基因烟草苗高、根长、鲜重和干重等生长指标均高于野生型。生理指标检测结果表明,在250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000和4℃处理24 h后,转基因烟草叶片丙二醛含量明显低于野生型烟草,分别为野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型烟草,分别达1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型烟草,分别为野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【结论】从紫花苜蓿中克隆了一个新的NAC转录因子基因MsNAC2,该基因能够对盐、冷害和干旱胁迫产生响应,与野生型烟草相比,过量表达MsNAC₂烟草具有较强的耐盐、抗旱和抵御寒冷的能力,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。     

泥鳅elovl1基因克隆、表达分析及其在低温胁迫下的响应

为探究泥鳅ELOVL1的功能和作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆泥鳅的elovl1基因,并分析elovl1基因的表达规律,最后将泥鳅分别暴露在26℃和8℃下饲养30d,研究低温胁迫对泥鳅脂肪酸组成、组织形态及elovl1基因表达的影响。结果发现:elovl1a全长为2 216bp,ORF为948bp,编码315个氨基酸;elovl1b全长为1 895bp,ORF为963bp,编码320个氨基酸。氨基酸序列特征如下:1个高保守的氧化还原组氨酸簇(HXXHH),多个跨膜区,氨基酸序列C端均含有内质网滞留信号(KXKXX)。elovl1a和elovl1b在所有组织中表达,elovl1a在每个组织的表达量均低于elovl1b。低温下总SFA明显降低(P0.05),总MUFA显著增加(P0.05)。低温显著诱导elovl1a、elovl1b表达。研究结果表明:泥鳅ELOVL1在脊椎动物中保守,ELOVL1可能在机体适应低温时,参与产生能量,起到重要的作用。     

水稻多逆境响应基因OsMsr13的克隆与功能分析

为了深入研究作物耐逆境胁迫的分子机制和发现新的水稻耐逆基因,采用Affymetrix基因芯片技术与水稻表达芯片(含51,279个转录本),分析了培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平变化,筛选出一批耐多逆境候选功能基因.OsMsr13是其中一个受低温、高温与干旱诱导,在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因.根据序列生物信息学分析,OsMsr13含有7个外显子和6个内含子,cDNA全长序列为1603bp,完整的ORF为1317bp,编码一个含438个氨基酸残基的蛋白质;在OsMsr13启动子区域发现多个与逆境应答相关的顺武作用元件;数据库查找和蛋白质多序列的比对表明Os Msr13的预测蛋白属于钙调素结合蛋白家族.为了进一步研究OsMsr13基因的功能,通过RT-PCR方法扩增到包含OsMsr13完整ORF的cDNA克隆,构建了含有OsMsr13重组基因的过量表达载体pCAM-JIT-OsMsr13,并经农杆菌介导法将重组基因导入到水稻中.转OsMsr13株系苗期的抗逆性试验表明OsMsr13过量表达能显著地提高水稻的耐寒性,但在抗旱和耐高温方面,转基因植株和野生型9311没有观察到多大差别.     

苎麻镉响应基因BnG6 PDH1的克隆和表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖代谢途径的关键限速酶,为探讨G6PDH基因在苎麻耐镉机制中的作用,本研究在苎麻镉胁迫转录组的基础上,采用RACE方法从苎麻(Boehmeria nivea L.)品种中苎一号中克隆到BnG6PDH1基因(GenBank登录号为MG941010)的全长cDNA序列,该基因开放读码框为1 554 bp,编码517个氨基酸,蛋白质分子量为59 250,等电点为5.92。BnG6PDH1编码的氨基酸与川桑(XP_010111634.1)、枣(XP_015878928.1)、甜樱桃(XP_021825040.1)、苹果(XP_008362117.1)和梅(XP_008231184.1)的胞质型G6PDH蛋白的相似性较高,相似度分别为92%、91%、89%、88%和88%。组织表达特异性分析结果表明,BnG6PDH1在苎麻叶中的表达量最高,其次为茎,根部的表达量最低。镉胁迫诱导表达分析结果表明,BnG6PDH1的显著表达受镉的诱导,表达量随着镉质量浓度的增加而增加。以上结果表明,BnMYB1是一个镉应答基因,可能在植物对镉胁迫的适应中发挥重要作用。     

气单胞菌低温淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

[目的]获得低温菌LA77的低温淀粉酶基因及其生物学信息.[方法]用16S rDNA序列分析对其进行了分子鉴定,并根据分类地位进行了特异引物设计和PCR扩增,通过生物学网站和软件对获得的基因及编码蛋白进行分析.[结果]低温菌LA77归属于气单胞菌属,PCR扩增获得一条编码703个氨基酸的完整开放阅读框的基因.通过生物信息学分析显示该蛋白质理论分子量约为77.9 kD,等电点为6.16,为亲水、且具有信号肽的跨膜蛋白.可能存在10个磷酸化位点,1个糖基化位点,二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成.基于氨基酸序列的结构域和系统进化树分析表明,该蛋白属于α-淀粉酶家族,极可能为低温淀粉酶.[结论]LA77低温淀粉酶基因的获得,将为低温淀粉酶基因的进一步改造、表达以及其酶低温催化机理的阐释奠定重要的基础.