花生AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油(TAG)合成途径的限速酶,对脂肪酸合成的调节具有关键作用。为了研究AhDGAT2a的表达调控,利用GenomeWalking方法从鲁花14基因组中克隆了AhDGAT2a上游5¢侧翼调控区1200 bp序列,即AhDGAT2a启动子(pAhDGAT2a)序列,并利用生物信息学软件分析其包含的调控元件,发现其含有多个TATA-box和CAAT-box、光调控元件、胁迫防御相关元件和激素响应元件。用pAhDGAT2a构建pAhDGAT2a:GUS植物表达载体并转化烟草品种SR1。利用组织染色法鉴定转基因烟草的GUS表达模式,发现在转基因烟草的各个器官均有GUS酶活,而在柱头、花药和幼嫩种子中表达量较高,说明pAhDGAT2a具有一定的组成型启动子活性。     

玉米ZmCIPK24-2基因在盐胁迫应答中的功能研究

土壤盐化会影响作物正常生长发育,导致农作物减产。植物在长期适应环境的过程中,进化出了相应的耐盐分子机制。钙调磷酸酶B类蛋白(CBL)及CBL互作蛋白激酶(CIPK)参与植物对盐胁迫的响应。本研究鉴定到一个拟南芥AtSOS2的同源基因ZmCIPK24-2,实时荧光定量聚合酶链式反应结果表明ZmCIPK24-2基因在玉米各组织部位广泛表达,其中在花粉表达量最高;ZmCIPK24-2受盐胁迫诱导表达。ZmCIPK24-2能部分互补拟南芥atsos2突变体的盐敏感表型,在高盐浓度下转基因株系比atsos2突变体的存活率显著提高,根长显著增长。亚细胞定位实验表明ZmCIPK24-2定位于细胞质、细胞膜与核膜。利用酵母双杂交实验及LUC互补成像实验发现ZmCIPK24-2与玉米CBLs家族中的ZmCBL1、ZmCBL4、ZmCBL8和ZmCBL9互作。本研究为解析玉米CBL-CIPK信号通路的功能提供了新的实验证据。     

甘蓝型油菜BnFAD2-C5基因启动子及内含子在表达水平的功能分析

富含油酸的菜籽油具有重要的经济价值,使得高油酸育种和形成机理的研究成为热点。油酸脱氢酶基因(FAD2基因)是控制油酸含量的关键酶基因。本文针对BnFAD2-C5基因展开研究,根据油菜和甘蓝的同源性,克隆了1257 bp启动子序列,利用GUS和GFP作为报告基因分别构建含有不同片段长度的启动子和内含子的缺失载体并转化拟南芥,经GUS染色检测发现–319 ~ –1 bp为该研究中最小启动子;采用Western技术分析启动子和内含子不同区域的功能,发现BnFAD2-C5启动子区域–1257 ~ –1020 bp和–319 ~ –1 bp能够诱导报告基因在转基因拟南芥种子发育中期高效表达,BnFAD2-C5内含子具有增强启动子转录水平的功能,该功能主要由631~1033 bp区域调控。     

普通菜豆PvP5CS2基因对逆境胁迫的应答

为了探索逆境条件下脯氨酸积累的分子遗传机理, 改善作物的抗逆能力, 应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和水杨酸法分别检测干旱、高盐(200 mmol L^-1 NaCl)和冷(4℃)胁迫条件下普通菜豆幼苗叶和根中脯氨酸合成酶基因PvP5CS2表达量和脯氨酸含量的变化。结果显示, 3种胁迫条件下普通菜豆幼苗叶和根中PvP5CS2的转录水平快速上升, 干旱处理4 d, 叶中PvP5CS2表达量达到最大值; 高盐处理下, 叶和根中PvP5CS2的表达高峰分别出现在2 h和6 h; 冷胁迫下, 叶和根中的表达高峰都出现在2 h; 随着胁迫时间的延长, PvP5CS2基因的转录水平逐渐下降。普通菜豆在逆境胁迫下, 幼苗叶和根中脯氨酸大量积累, 积累高峰出现在PvP5CS2基因表达高峰之后。这些结果说明, PvP5CS2基因的表达受干旱、高盐和冷胁迫诱导, 脯氨酸积累受PvP5CS2基因转录水平的调控。PvP5CS2基因在洋葱表皮细胞中的瞬时表达结果显示PvP5CS2蛋白定位在细胞核和膜上。     

普通菜豆PvP5CS2基因对逆境胁迫的应答

为了探索逆境条件下脯氨酸积累的分子遗传机理, 改善作物的抗逆能力, 应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和水杨酸法分别检测干旱、高盐(200 mmol L^-1 NaCl)和冷(4℃)胁迫条件下普通菜豆幼苗叶和根中脯氨酸合成酶基因PvP5CS2表达量和脯氨酸含量的变化。结果显示, 3种胁迫条件下普通菜豆幼苗叶和根中PvP5CS2的转录水平快速上升, 干旱处理4 d, 叶中PvP5CS2表达量达到最大值; 高盐处理下, 叶和根中PvP5CS2的表达高峰分别出现在2 h和6 h; 冷胁迫下, 叶和根中的表达高峰都出现在2 h; 随着胁迫时间的延长, PvP5CS2基因的转录水平逐渐下降。普通菜豆在逆境胁迫下, 幼苗叶和根中脯氨酸大量积累, 积累高峰出现在PvP5CS2基因表达高峰之后。这些结果说明, PvP5CS2基因的表达受干旱、高盐和冷胁迫诱导, 脯氨酸积累受PvP5CS2基因转录水平的调控。PvP5CS2基因在洋葱表皮细胞中的瞬时表达结果显示PvP5CS2蛋白定位在细胞核和膜上。     

花生AhFAD2基因的多态性及其与籽粒油酸/亚油酸比值间的相关性

高油酸低亚油酸的花生油稳定性好、营养价值高,培育高油酸/亚油酸比值(O/L)的花生品种一直是花生育种的重要目标。为深入了解控制花生O/L比值的遗传基础,提高花生品质育种效率,对鲁花14等13个花生品种Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2基因的编码区进行了序列分析。结果表明,该基因在13个花生品种中皆存在3类转录本,即AhFAD2A、AhFAD2B和假基因。台山珍珠、台山三粒肉、江田种、Chico、05-21063、白沙1016的基因型是OL1OL1OL2OL2;临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、鲁花14、花育19、花育23的基因型是ol1ol1OL2OL2;鲁花11的基因型可能存在OL1ol1杂合等位位点。在个别品种中AhFAD2A基因的若干位置存在多态性;AhFAD2B基因相对保守,所测13个花生品种的核苷酸序列基本相同。结合13个花生栽培品种籽粒中O/L比值测定的结果,初步探讨了基因多态性与O/L比值之间的关系,同时对假基因可能存在的功能进行了讨论。     

小麦穗发芽抗性相关Vp1基因启动子的分离及功能验证

成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和休眠的重要转录因子, 对小麦种子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦B基因组Vp1基因的启动子, 生物信息学预测结果表明, 其含有9个脱落酸响应元件ABRE、2个DREB和6个MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件GARE、1个水杨酸响应元件TCA-E、2个茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、4个SKn-1和1个RYREPE胚乳特异表达元件。采用5′端缺失的方法, 构建了系列含Vp1启动子不同区段融合GUS报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪转化小麦愈伤组织, 瞬时表达结果显示, Vp1启动子在无诱导的情况下不能启动GUS基因表达, 在低温、ABA、GA、PEG和NaCl诱导后可以启动GUS基因表达, 表现诱导表达特性, 且其诱导表达强度随启动子缺失片段长度变短而减弱。利用Gateway方法成功构建了6个启动子各缺失片段类型的植物表达载体, 并通过农杆菌介导转化四倍体小麦Stewart, 获得转基因植株。该启动子可有效启动GUS基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达, 其他组织中没有表达。当启动子片段大于660 bp时, 外源ABA可诱导启动子启动GUS基因在转基因植株茎节中的表达。     

水稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

以水稻品种"密阳46"的DNA为模板, 用PCR方法从水稻谷蛋白基因Gt1上游序列扩增出特异性条带, 并克隆出种子特异性启动子. 经鉴定, 它的长度为929 bp, 与Takaiwa(1987)报道的序列仅有12个核苷酸的差异, 已知的功能部位序列没有发生改变. 用它构建了带动报告基因Gus表达的双元载体, 并用农杆菌介导法转化水稻得到了转基因植株.     

花生FAD2基因家族表达分析及其对低温胁迫的响应

为了探究FAD2在花生低温响应中的作用,本研究从普通油酸花生中花16 (ZH16)和高油酸花生中花413 (ZH413)中克隆得到花生AhFAD2家族的全部基因,共7个。通过分析这些基因的表达模式发现,在ZH16和ZH413中各FAD2基因表达模式相似, AhFAD2-1A/B主要在花和发育的种子中表达, AhFAD2-3A/B主要在营养组织中表达, AhFAD2-4A/B主要在根和花中表达,表明AhFAD2基因在花生不同发育阶段和不同组织中发挥各自的生物学功能。在15℃下发芽6 d发现,ZH413的发芽率未显著下降,而ZH16的发芽率显著下降。种子萌发过程中,AhFAD2-1A/B和AhFAD2-4A/B均受低温诱导表达。在ZH16中AhFAD2-1A/B在低温诱导第6天开始显著上调表达,而在ZH413中第1天显著上调表达;在ZH16中AhFAD2-4A/B在低温诱导第3天出现显著上调表达,之后表达量下降,但在ZH413中第1天就显著上调表达,且始终维持在高水平表达。基于以上研究结果推测,高油酸花生在受到低温胁迫时,AhFAD2-1A/B编码蛋白失活,但AhFAD2-4A/B的高量表达在一定程度上弥补了这部分功能。同时也说明AhFAD2-1A/B功能的缺失并不是决定花生耐寒性的主要因素。本研究的开展为培育抗寒的高油酸花生品种奠定了理论基础,为高油酸花生在高纬度、高海拔地区推广提供了理论支持。     

野生大豆碳酸盐胁迫应答基因GsMIPS2的克隆及功能分析

为挖掘野生大豆(Glycine soja L.G07256)耐碳酸盐关键功能基因,利用前期高通量转录组测序数据,从构建的碳酸盐胁迫基因表达谱中,选取了一个碳酸盐胁迫下显著上调表达的肌醇-1-磷酸合酶类基因。采用同源克隆的方法,获得该基因的全长cDNA,命名为GsMIPS2。实时荧光定量PCR结果显示该基因受碳酸盐胁迫诱导表达,并且其表达量具有组织特异性。将GsMIPS2基因转化拟南芥,并结合拟南芥中T-DNA插入突变体atmips2来验证其耐碳酸盐功能。结果表明,碳酸盐胁迫条件下,GsMIPS2超量表达拟南芥种子萌发率显著高于野生型,而拟南芥突变体atmips2种子萌发率显著低于野生型。上述结果表明,GsMIPS2基因在植物应答碳酸盐胁迫过程中起重要作用。     

鸭POU1F1基因第2内含子多态性及其遗传效应

为探究褐色菜鸭POU1F1基因的多态性及其遗传效应,本试验采用PCR-SSCP方法检测了褐色菜鸭POU1F1基因的多态性,分析了多态位点不同基因型与褐色菜鸭生产性状的关联性。结果表明：POU1F1基因第2内含子存在3种基因型即AA型、Aa型和aa型,序列比对存在2个突变位点即A3980T和A3988G,该位点属低度多态,?2检验结果表明该基因座位处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);关联分析显示：AA基因型个体的蛋形指数和四周龄体重均显著高于aa型(P＜0.05),但三种基因型对其他性状无显著影响(P>0.05)。推测该片段的多态位点可能对四周龄体重和蛋形指数有一定的影响,POU1F1基因第2内含子可作为褐色菜鸭生产性能的优势分子标记。     

花生AhSOS2基因的克隆及功能初探

SOS2 (Salt Overly Sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因, 在调控细胞内离子平衡及参与植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本研究通过RACE的方法, 从花生叶片中分离到一长1462 bp、包含1341 bp开放阅读框(ORF)的cDNA片段, 生物信息学分析显示, 该基因属SOS2类基因, 被命名为AhSOS2(GenBank登录号为HG797656), 编码446个氨基酸, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。对基因表达特性的荧光定量PCR分析显示, AhSOS2在花生中为组成型表达; 且受盐胁迫及干旱诱导。经250 mmol L^-1 NaCl处理后, 该基因在花生幼苗茎中被诱导表达, 表达量约是对照茎中的30倍; 而在30% PEG-6000模拟干旱处理下, 该基因在花生幼苗叶中表达量也明显升高。综合以上结果, 显示AhSOS2可能参与并调控花生对逆境的抗性及耐受性。目前, 已成功构建了AhSOS2的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2并获得转基因植株, 初步功能分析显示, 过表达AhSOS2基因的转基因水稻对盐胁迫的耐受性提高。预期这方面的工作对于解析花生对盐害、干旱等逆境的适应及防御机制, 进而指导花生抗性育种及品质改良具有重要意义。     

梭梭HaFT-1、HaFT-9基因启动子克隆及胁迫响应分析

14-3-3蛋白是一类普遍存在于真核生物中的分子伴侣,研究表明梭梭14-3-3蛋白HaFT-1和HaFT-9功能与胁迫响应密切相关。为进一步分析HaFT-1和HaFT-9基因胁迫响应机制,本研究采用染色体步移技术扩增HaFT-1和HaFT-9基因5’端上游调控序列,分别获得961和879 bp启动子序列。序列分析表明二者启动子除含有基本的启动子核心元件外,还包含多种逆境响应元件。分别构建HaFT-1和HaFT-9基因启动子-GUS重组载体瞬时转化烟草、棉花、梭梭幼苗,GUS染色结果显示：二者启动子在正常生长条件或高温、脱水、NaCl胁迫及ABA处理下均能调控GUS表达,并且HaFT-1启动子对以上处理的响应更加明显;在高温胁迫下,梭梭幼苗中二者启动子调控的GUS表达具有组织特异性。RT-qPCR结果显示,在梭梭幼苗中,高温、脱水、NaCl胁迫及ABA处理下HaFT-1和HaFT-9基因表达趋势与以上GUS染色结果基本一致。本研究为进一步阐明HaFT-1和HaFT-9基因在胁迫响应中的作用机制提供了科学依据。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

一个玉米类ABC1基因ZmABC1-10的克隆及其对镉等非生物胁迫的应答

镉是一种非必需的重金属元素, 对动植物有严重毒害作用。几个与ABC1(activity of the bc1 complex)家族有关的基因参与植物镉胁迫的应答。本研究从玉米中克隆并鉴定了一个类ABC1基因, 命名为ZmABC1-10。该基因cDNA全长2 519 bp, 包含一个2 250 bp的开放阅读框, 编码一个预测的叶绿体膜蛋白。启动子顺式元件扫描发现该基因含有大量的非生物胁迫、光以及植物激素应答元件。表达模式分析表明, 该基因主要在叶片、茎秆等绿色组织中表达。镉处理实验表明, 该基因能够被诱导并且受植物发育时期的调控。除镉之外, 该基因还受多种非生物因素包括ABA、H₂O₂、干旱和黑暗的共同调控。此外, 本研究利用基因组序列信息共鉴定出19个玉米ABC1基因。对植物界8个代表性物种中148个ABC1蛋白进行系统发育分析表明, 在长期进化过程中植物ABC1蛋白已经发生了分化; 物种特异性扩张是植物中该家族进化的主要动力。这些结果表明ZmAbc1-10是一个镉应答因子并且可能在植物对非生物胁迫的适应中发挥重要作用。     

猕猴桃NIP5-1基因的克隆及缺硼胁迫表达分析

通道蛋白家族NIPs(NOD26-like intrinsic proteins)是植物中重要的硼吸收与转运蛋白。利用同源克隆技术获得"金魁"猕猴桃(Actinidia deliciosa‘jinkui’)硼转运通道基因:AdNIP5-1,该基因序列包括897 bp的开放阅读框,编码298个氨基酸。AdNIP5-1蛋白包含通道蛋白家族2个典型的保守结构域:NPS、NPV和Ar/R,构建基因家族进化树分析AdNIP5-1属于NIPⅡ亚家族,与葡萄和拟南芥中的NIP 5-1蛋白序列比对一致性分别为:89%和82%。利用实时荧光定量分析表明AdNIP5-1主要在猕猴桃根部表达,在茎和叶中的表达量相对较低;在缺硼胁迫条件下,AdNIP5-1表达量显著升高,在12 h时达到最高值,为对照的2.1倍。结果表明AdNIP5-1基因参与缺硼胁迫响应过程,该基因可能会影响猕猴桃对硼的吸收效率。     

油葵HaFAD2-5基因的克隆及其对低温和光照的响应

油葵(Helianthus annuus L.)是世界重要的油料作物之一,种子中含有大量亚油酸,但其合成与调控机制尚不清楚。本实验利用RT-PCR技术从油葵叶片中克隆了一个FAD2家族基因,命名为HaFAD2-5。并使用半定量RT-PCR分析其在低温和光照处理下的表达模式。结果表明,HaFAD2-5基因的开放阅读框(ORF)为1 113 bp,编码蛋白质含370个氨基酸,等电点(p I)为6.52,相对分子质量为43.21 kD。半定量RT-PCR表明,低温和光照处理可调节HaFAD2-5在油葵根、茎和叶中的表达,但响应程度不同。茎和叶中HaFAD2-5的表达量在低温下增高;暗处理1 d和2 d后,根和叶中HaFAD2-5的表达量下降;暗处理1 d后,茎中HaFAD2-5的表达量达到最高,暗处理2 d后又降低。研究表明,HaFAD2-5可能参与油葵对低温胁迫应答的调节,并且其表达具有昼夜节律性。     

花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(Ah SAD)起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5'RACE方法获得了该基因的5'UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。     

木薯碱性/中性转化酶MeNINV1基因启动子的克隆及激素应答表达分析

为了解木薯碱性/中性转化酶基因MeNINV1对激素的应答模式及调控机制本研究采用PCR技术,从木薯基因组中分离出MeNINV1基因启动子序列。分析结果显示该启动子长度1 714 bp,含有TATA box和CAAT box保守元件,以及四个激素响应元件:ERE(乙烯应答)、ABRE(ABA应答)、TAC-element(SA应答)和P-box(GA应答)。根据启动子上存在的参与激素应答相关的顺式作用元件信息,选用30μmol/L GA3、30μmol/L ABA、100μmol/L SA和1%乙烯利四种外源激素胁迫处理木薯SC8组培苗,利用实时荧光定量PCR技术,研究MeNINV1基因在不同激素处理下的表达模式。结果表明,MeNINV1基因的表达受激素的调控,因此推断碱性/中性转化酶基因MeNINV1启动子上的激素应答元件响应激素诱导,调控基因的表达。研究结果为进一步研究激素信号如何调控木薯块根蔗糖的分解代谢提供理论基础。     

新疆哈密瓜AT2基因的克隆及初步功能验证

本研究利用RT-PCR技术从抗霜霉病哈密瓜(Cucumis melo L.)品种MR-1中克隆到AT2基因,其整编码区为1 229 bp,编码401个氨基酸,同源比对结果为99%,将其编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶蛋白序列与多种物种进行系统进化树分析,结果显示,甜瓜与黄瓜SGT蛋白同源性较高,遗传距离最近,推测在同属中该蛋白进化相对保守。在线分析表明SGT蛋白不含信号肽及跨膜区,即该蛋白为非跨膜蛋白。RT-PCR分析表明AT2基因随着植株生长时期不同表达量不同,开花期表达量最高,幼苗期至开花期表达量呈上升趋势;且不同组织中,叶片表达量显著高于茎、根。构建了p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,运用农杆菌介导法转化烟草,抗性筛选获得7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,AT2基因在不同株系转基因烟草T0代中表达量均高于野生型。通过对转基因烟草进行抗病性鉴定,转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草。本研究表明,过表达AT2基因能够提高烟草对部分真菌性病害的抗性。